固定化酶的制备：固定化酶的制备方法

固定化酶制备及酶活力测定

实验者张玲玲绿药1班[1**********]6 同组者金雨馨、管青青

实验日期2015/3/13 报告完成日期2015/3/20

实验指导易喻

摘要酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的

催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。

关键词固定化酶酶活力包埋法

AbstractEnzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In

this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.

前言酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区

域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。

正文

实验过程

1试剂与仪器

1试剂

①海藻酸钠、0%氯化钙②碱性蛋白酶（0mg/mL）③福林试剂

④1%酪蛋白溶液⑤PH10缓冲液⑥标准酪氨酸溶液

⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液2仪器①磁力搅拌器②恒温水浴锅③注射器

④烧杯（100mL,500mL）⑤布氏漏斗⑥分析天平⑦容量瓶⑧移液管

⑨721分光光度计

2操作步骤

1酶的固定化

称取00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。

用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。1酶活力的测定

1制备酪氨酸标准曲线

(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表）(2) 在上述7支试管中，分别加入，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。(3)分别吸取滤液1mL 放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。

(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

0 1 2 3 4 5 6

酪氨酸含量（μg ）

0 100 200 300 400 500 600

1㎎/mL酪氨酸标准溶液（mL）

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

蒸馏水( mL ) 0 9 8 7 6 5 4

2固定化酶活力测定

上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL

三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。

摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，