固定化酶的制备：固定化酶的制备方法
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是一种将酶固定在载体上的技术，可以提高酶的稳定性和重复使用性，从而降低生产成本和提高生产效率。
固定化酶技术已经广泛应用于食品、医药、化工等领域。
固定化酶的方法主要有物理吸附、共价键结合和交联固定等。
其中，物理吸附是将酶通过静电作用或疏水作用吸附在载体表面，共价键结合是通过化学反应将酶与载体共价键结合，交联固定则是通过交联剂将酶与载体交联在一起。
物理吸附是一种简单易行的固定化酶方法，但其稳定性较差，易受温度、pH值等因素影响。
共价键结合可以提高酶的稳定性和重复使用性，但其制备过程较为复杂，成本较高。
交联固定则是一种既简单又稳定的固定化酶方法，但其交联剂的选择和使用量需要仔细控制，否则会影响酶的活性和稳定性。
固定化酶技术的应用范围非常广泛。
在食品工业中，固定化酶可以用于酿造、发酵、果汁加工等过程中的酶解反应，从而提高产品质量和生产效率。
在医药工业中，固定化酶可以用于药物合成、酶替代治疗等领域，从而提高药物的纯度和效果。
在化工工业中，固定化酶可以用于催化反应、废水处理等领域，从而提高反应效率和环保性能。
固定化酶技术是一种非常重要的生物技术，可以提高酶的稳定性和
重复使用性，从而降低生产成本和提高生产效率。
随着科技的不断发展，固定化酶技术将会在更多的领域得到应用。
固定化酶的化学制备方法
固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。
固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。
第一种是物理固定化法。
这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。
常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。
吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。
沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。
共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。
第二种是化学固定化法。
这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。
选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。
交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。
第三种是生物固定化法。
生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。
这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。
以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。
在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。
制备固定化酶实验报告
一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
固定化酶技术及应用的研究进展
固定化酶技术及应用的研究进展一、固定化酶的制备方法研究进展固定化酶的制备方法包括物理吸附、共价键结和交联结构等。
近年来，研究者们发展了一系列新型的固定化酶制备方法，如钙凝胶法、包埋法、凝胶微球法和溶胶凝胶法等。
这些新方法不仅提高了固定化酶的稳定性和活性，还大幅度降低了制备成本，提高了酶的重复使用性。
固定化酶在生物工程领域的应用主要集中在酶催化反应、生物催化剂制备以及生物催化剂的应用等方面。
例如，固定化酶可以用于生物反应器中进行酶催化反应，实现对废水处理、医药合成和食品工业等的高效处理。
此外，固定化酶还可以用于制备各类生物催化剂，如药物微胶囊和生物传感器，用于治疗疾病和检测生物分子。
固定化酶在食品工业中的应用主要包括生产酶制剂、降解保健食品、生产高价值添加物以及改善食品品质等方面。
固定化酶可以用于生产各类酶制剂，如发酵酶、复合酶和水解酶等，以加速酶催化反应。
此外，固定化酶还可以用于生产特殊功能食品，如降解保健食品、胶原蛋白等，以满足不同人群的需求。
固定化酶在医药学领域的应用主要包括药物制剂、生物芯片、药物代谢和生物传感器等方面。
例如，固定化酶可以用于制备缓控释药物制剂，以提高药物的疗效和降低副作用。
此外，固定化酶还可以用于制备生物芯片，用于分析疾病标志物和药物代谢产物等。
固定化酶在环境保护领域的应用主要包括废水处理、大气污染控制和土壤修复等方面。
固定化酶可以用于废水处理中，加速有害物质的降解和去除。
此外，固定化酶还可以用于大气污染控制，将有害气体转化为无害物质。
固定化酶还可以用于土壤修复，加速土壤中有毒物质的降解和去除。
综上所述，固定化酶技术在多个研究领域取得了重要的进展。
通过不断创新和改进固定化酶制备方法，研究者们加强了固定化酶的稳定性和重复使用性，提高了酶的应用效果和利用价值。
固定化酶技术的进一步发展，将为生物工程、食品工业、医药学和环境保护等领域带来更多创新和突破。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
固定化酶的生产
酶的固定化技术摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。
它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。
这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。
关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future.Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。
固定化酶又称固相酶。
在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
一、 酶的固定化方法酶的固定化方法总体分为：可溶性酶的方法和不溶性酶的方法。
固定化酶方法
固定化酶方法固定化酶技术是一种将酶固定在载体上使其具有更好稳定性和重复性的技术，也被称为酶固定化技术。
这种技术已经广泛应用于许多领域，比如制药、食品工业、环境科学等等。
固定化酶技术具有许多优点，如升高反应效率，增加反应速度，降低成本等。
实际上，固定化酶技术主要分为物理固定化方法和化学固定化方法两种。
物理固定化方法是基于酶与载体的物理吸附作用进行的，目前常用的载体有玻璃、硅胶、氧化铝等。
物理固定化酶过程易于操作，不需要特殊合成或化学反应，但缺点是固定酶效果可能不稳定，在重复反应中会出现活性的波动。
化学固定化方法通常依赖于特定的化学反应，比如交联反应、胆碱化等等，其中最常见的固定化方法是交联方法。
交联反应可以使酶和载体之间形成化学键，从而实现酶的固定化。
但需要注意的是，化学固定化方法可能会对酶的活性造成影响，导致固定化后酶的活性有所降低。
当然，不同的酶有不同的理想固定化方法，因此可以根据具体需求选择合适的方法。
在确定固定化酶的方法后，下一步是在合适的载体上固定酶。
常用的载体有硅胶、高分子材料、金属氧化物、碳材料等。
硅胶比较容易制备，成本较低，不过硅胶的稳定性和操作适用广度可能不如其他材料。
高分子材料如聚醚酮、聚酰亚胺等对大多数酶具有较好的稳定性和活性保持能力。
而金属氧化物和碳材料则具有出色的化学和物理稳定性，但同时也比较昂贵。
固定化酶的方法选择后，就可以进行实验。
首先需要对酶进行预处理，清洗、去溶剂或悬浮剂等处理，以保证酶在固定化过程中的活性。
然后将酶溶液滴到载体上，等待载体干燥，可以在常规温度下进行干燥。
接下来，可以进行酶的特性分析，比如酶的活性、稳定性、寿命等等。
总之，固定化酶技术是一种广泛应用于不同领域的方法，具有许多优点。
选择合适的载体和固定化方法可以大大提高酶的稳定性和活性，但需要了解不同的载体和固定化方法对酶活性的影响，选择最适合的固定化方法。
固定化酶的四种方法[整理版]
![固定化酶的四种方法[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/b7b86d0ab6360b4c2e3f5727a5e9856a56122632.png)
1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。
2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
3载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。
在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。
参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
高中生物 3.2 固定化酶的制备和应用课件 苏教版选修1
探究点一 探究点二 探究点三
2.结果分析与评价 (1)凝胶珠的颜色和形状:如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色,说明海藻 酸钠的浓度偏低,固定的酵母细胞数目较少;如果形成的凝胶珠不是圆形或椭 圆形,则说明海藻酸钠的浓度偏高,制作失败,需要再作尝试。 (2)检验凝胶珠的质量是否合格,可以使用下列方法。一是用镊子夹起一 个凝胶珠放在实验桌上用手挤压,如果凝胶珠不容易破裂,没有液体流出,就表 明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠,如果凝胶珠很容易 弹起,也能表明制备的凝胶珠是成功的。
提示:固定化酵母细胞包埋在海藻酸钠内,不容易与葡萄接触。可用葡 萄糖溶液代替鲜葡萄,将固定化酵母细胞加到葡萄糖溶液中发酵,葡萄糖容 易透过海藻酸钠进入到凝胶珠内部。
探究点一 探究点二 探究点三
●名师精讲●
1.实验流程的几点提醒 (1)选用的干酵母要具有较强的活性,而且物种单一。 (2)酵母菌细胞活化时体积会变大,因此活化前应选择体积足够大的容器, 防止酵母菌细胞的活化液溢出。 (3)海藻酸钠溶液的配制是固定化细胞的关键,因为如果海藻酸钠浓度过 高,将很难形成凝胶珠,如果浓度过低,形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数 量少,也会影响实验结果。 (4)溶化海藻酸钠时要用小火或间断加热,避免海藻酸钠发生焦糊。 (5)将溶化后的聚乙烯醇—海藻酸钠溶液先冷却至 45 ℃,再与预热至 35 ℃ 的酵母菌培养液混合,避免高温杀死酵母菌细胞。要混合均匀,不要进入气泡。 (6)固定化酵母菌细胞时,应将酵母菌—聚乙烯醇—海藻酸钠胶液用注射 器以恒定速度缓慢滴入饱和硼酸—氯化钙溶液中,而不是注射,以免影响凝胶 珠的形成。 (7)细胞的固定要在严格的无菌条件下进行,如定容时要用蒸馏水,冲洗凝 胶珠要用无菌水。
固定化细胞 一系列酶 明胶、琼脂糖、海藻酸 钠、醋酸纤维素、聚丙烯 酰胺 包埋法
固定化酶的制备及应用
固定化酶的制备及应用徐玉尚 08生工（2） 20080804243摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
本文主要从传统固定化酶技术以及新型固定化酶技术两大方面介绍了固定化酶的制备方法。
另外，又对固定化酶在医药、食品、环保、生物传感器、能源五大方面的应用作了综述。
本文旨在进一步研究固定化酶的制备方法以及探究固定化酶在多个领域的应用。
关键词：固定化酶；制备；载体；应用酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
现今，固定化酶的制备方法已由传统走向新型，并在多个领域有重要应用[1]。
1固定化酶的传统制备方法1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
高中生物苏教版高二选修1课件：第三章_第二节_固定化酶的制备和应用
1．直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的 一种或几种
种类
一种
一系列酶
常用 载体
纤维素、琼脂糖、硝 明胶、琼脂、海藻酸
酸纤维素、聚丙烯酰 钠凝胶、角叉菜胶
胺凝胶
一分耕耘一分收获
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
制作方法
物理吸附法、化学 包埋法、物理 结合法、包埋法 吸附法
一分耕耘一分收获
固定化酶和固定化细胞的原理、作用
[例 1] (江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙
述，正确的是
()
A．可用包埋法制备固定化酵母细胞
B．反应产物对固定化酶的活同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
一分耕耘一分收获
[思路点拨]
一分耕耘一分收获
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a 代表________，
b 代表________。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原
因是__________________________________________________。
为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程
质，反应效率下降
一分耕耘一分收获
酵母菌细胞的固定化技术
一分耕耘一分收获
一分耕耘一分收获
1．酵母细胞固定前要活化，原因是什么？ 提示：在缺水状态，微生物处于休眠状态。活化就是让处于 休眠状态的酵母细胞恢复正常的生活状态。 2．为什么麦芽汁可以被质量分数为 10%的葡萄糖溶液替代？ 提示：酵母菌也可以利用葡萄糖作为营养物质。 3．为什么说海藻酸钠适用于多种细胞的固定化？ 提示：用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞，除对细胞无 毒性外，还具有操作简便、条件温和等特性。通过改变海藻酸钠 的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
实验三酶的固定化
•
•
• 二、实验材料、仪器与试剂
• （一）实验材料与仪器
• 干燥箱；电子天平；注射器；碘量瓶；磁力搅拌器；pH 计；恒温水浴锅等。
• （二）主要试剂
• 糖化酶；3%海藻酸钠溶液；2%氯化钙溶液。 2％可溶性 淀粉液； pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液； 0.1mol／L碘 液； 0.1mol／L氢氧化钠溶液； 1mol／L硫酸溶液； 0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液； 0.5％淀粉指示剂。
• 四、实验数据基本要求 （一）酶活力计算
在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。
（二）固定化酶活力回收率计算
固定化酶总活力 活力回收率= 游离酶总活力
（三）固定化酶比活力计算
•
三、实验内容
• （一）固定化酶的制备
• 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 • 2、取糖化酶2g，悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 • 3、用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中，浸泡20 min 左右。 • 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶。置 于4℃冰箱中冷藏备用。
• 实验三
酶的固定化
• 一、实验基本原理 • 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙பைடு நூலகம்液。 形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成 固定化酶。 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）活性测定原理：在一定条 件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂 次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减 少量计算葡萄糖的量，从而计算算酶活力。
• （二）糖化酶活力测定
• 1、吸取2%可溶性淀粉10ml，加入pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液5ml，混匀后 于40℃水浴预热10min。 • 2、加入酶液1ml（空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液），于40℃，反 应10min。反应结束时，于沸水浴中煮10min，以终止反应。 • 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol／L碘液及0.1mol／L氢氧化 钠溶液各5ml，摇匀，于室温下在暗处放置15min，加入2ml硫酸酸化。 • 4、以0.5％可溶性淀粉为指示剂，用0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色 消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数（A），以及空白实验消耗的 硫代硫酸钠溶液毫升数（B）。
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固定化酶制备及酶活力测定
实验者张玲玲绿药1班[1**********]6 同组者金雨馨、管青青
实验日期2015/3/13 报告完成日期2015/3/20
实验指导易喻
摘要酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的
催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。
本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。
结果表明固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
关键词固定化酶酶活力包埋法
AbstractEnzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In
this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.
前言酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区
域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。
与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。
依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。
其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。
所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。
分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。
它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。
酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
正文
实验过程
1试剂与仪器
1试剂
①海藻酸钠、0%氯化钙②碱性蛋白酶（0mg/mL）③福林试剂
④1%酪蛋白溶液⑤PH10缓冲液⑥标准酪氨酸溶液
⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液2仪器①磁力搅拌器②恒温水浴锅③注射器
④烧杯（100mL,500mL）⑤布氏漏斗⑥分析天平⑦容量瓶⑧移液管
⑨721分光光度计
2操作步骤
1酶的固定化
称取00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。
1酶活力的测定
1制备酪氨酸标准曲线
(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
（见下表）(2) 在上述7支试管中，分别加入，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
(3)分别吸取滤液1mL 放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量（μg ）
0 100 200 300 400 500 600
1㎎/mL酪氨酸标准溶液（mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水( mL ) 0 9 8 7 6 5 4
2固定化酶活力测定
上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL
三氯醋酸溶液。
对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，。