植物转基因方法及特点和转基因沉默现象

综上所述，基因沉默可能来源于转基因植株 体内的不同核酸之间的相互作用，即DNA— DNA、DNA—RNA、RNA—RNA的非正常配 对作用而导致基因核苷酸的甲基化作用和 mRNA的降解，从而引发基因沉默。基因沉默 可能是植物防御机制的一种自然现象——在 DNA或RNA水平上抵御外源DNA，就象植物 体内的对细菌、病毒的天然抗性一样[11]。这 一现象给转基因工作者提出了新的难题，它 已经成为转基因技术的严重障碍。它要求我 们不断去探索、改进植物转基因技术，做到 转基因定点、定量转化重要农作物，并得以 稳定、高效表达，从而加速转基因技术在农 业生产中的应用。
2．1 植物转录基因沉默（TGS） 植物转录基因沉默（TGS）
植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和 反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高 甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发 生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（position effect variegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以 象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递 进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因 整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默， 这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致 的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。 有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引 起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化） 和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相 关联的普遍特征[11]。
1．3 显微注射法、电击法及激光法 显微注射法、 显微注射法（microinjection）是用显微注射器 将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培 养最终获得转化植株。此项技术起初主要应 用于动物，八十年代中期开始应用于植物的 遗传转化。虽然该法具有DNA注射的准确性、 预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其 又有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其 应用受到了限制。自基因枪法诞生以来，这 种转化方法在植物上的应用走入了低谷[2]。
专题讲座
——植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
原文刊登于安徽技术师范学院学报 2003年第1期 崔广荣
1 植物的遗传转化方法及特点
植物基因工程研究中的关键步骤之一是通过特 定的方法将外源基因导入受体植物细胞内，使 之发生定向的、永久性的遗传变异，即所谓的 植物遗传转化（genetic transformation）。为了 方便有效地将外源基因导入植物体内，人们不 断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前 发展较为成熟的方法有农杆菌介导法、基因枪 法、电击法、PEG法、花粉管通道法、微注射 法、激光法等，其中基因枪法和农杆菌介导法 是最为有效的两种方法。
1．4 花粉管通道法 花粉管通道法（pollen-tube pathway）又称子房 注射法（overy injection），是将外源DNA注入 到子房中轴的胎座位置，经形成的花粉管胚囊， 转化受精卵或胚细胞。这是一种在整体水平上 的转化方法，可使外源基因转移的操作直接在 栽培作物上进行，免除了细胞和组织培养程序， 并可直接获得转化的种子，开创了整株活体基 因转化的新途径。这种方法是中国科学院上海 植物生理研究所周光宇等在长期的科学研究中 建立和发展起来的。不过这种方法看似简单但 操作要求极为严格[3]。
2 转基因植物中的基因沉默现象
近年来人们发现几乎在所有的转基因方法得 到的转基因植株中，都有外源基因在整合进 基因组后，出现基因沉默（gene silence）现 象[11]，转基因在受体植株中的表达水平很不 稳定。这已经成为植物遗传转化技术应用于 基础和应用研究的严重障碍。因此研究外源 基因沉默的分子机理及其相应的解决方法已 经成为当代分子生物学研究的一个热点。目 前对转基因植物中的基因沉默现象已经有了 较为深入的研究，但对其分子机理的理解及 相应的控制手段还很有限。
不过English等于1996年发现，并非所有的基因沉默 体系中的转基因转录水平都是很高的[7]，表明还有 其它一些因素起着引发基因沉默的作用。需要说明 的是并非所有的转基因体系均发生PTGS，能够发生 PTGS的转基因位点可能具有这些特点：第一，重复 顺序的出现可能允许DNA—DNA的相互作用，甲基 化、异染色质化等阻碍正确转录，产生异常RNA； 第二，使用强驱动子驱动基因的表达，可能有助于 提高RNA聚合酶的错误结合而产生异常RNA的含量， 当达到阈值水平时引发PTGS。也可能因异常RNA和 mRNA在细胞质中的积累，通过反馈机制使转基因 编码序列甲基化[22]。由此可见，强启动子或转基因 重复序列的出现可能引起异常RNA和相应的cRNA产 生而导致PTGS。
1．2 PEG法 PEG法 PEG法是一种通过化学物质PEG（聚乙二醇） 处理去壁的原生质体作为转化受体，改变细 胞膜的通透性而使原生质体获得转化。Krens 等首次通过此法在烟草中获得成功。此后许 多人在双子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、 水稻、玉米等都获得了成功。由于PEG法的实 验成本低廉、结果也较稳定、重复性好、无 需特殊的仪器设备等特点，因而在发明起初 也成为应用较为广泛的方法。但是此法具有 明显的缺点：原生质体培养再生难度较大； 受基因型限制；原生质体再生培养的转化植 株变异率高，易产生白化苗；转化率低[4]。
植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和 反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高 甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发 生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（position effect variegation）很相似[12]。植物中的甲基化可 以象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传 递进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝 基因整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉 默，这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而 导致的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活 [5]。有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也 能引起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超 甲基化）和染色质凝集（异染色质化）是与转录基 因沉默相关联的普遍特征[11]。
1．1基因枪法 基因枪法（particle gun bombardment； microprojectile bombartment；biolistics） 是1987年由美国康奈尔大学的Sanford提 出的一种直接基因导入法，它避开了原 生质体再生植株培养的困难和当时人们 认为的所谓的农杆菌的宿主限制问题。 这种方法是籍高速运动的金属粒将附着 于其表面的核酸分子引入受体细胞，然 后通过组织培养再生出完整植株。
Байду номын сангаас
由于基因枪法导入外源基因的技术本质上 是一种物理过程，因此它具有不用原生质 体再生培养、受体材料来源广泛、不受基 因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、 获得的转基因植株变异率低、通常具有正 常的育性等优点[1]。特别是在单子叶禾本科 植物中得到了较为广泛的应用。但是基因 枪法也有自身的缺点：转化效率不高，大 多在0.1~1.0%的范围内，难以选择；外源基 因序列常是多拷贝插入，从而导致基因沉 默；转入的基因有时是呈非孟德尔遗传； 费用较高等[4]。
电击法（electroporation）是八十年代初发展起来的 一种转化技术，首先在原生质体上运用此法将CAT 基因（氯霉素乙酰转移酶基因）转移到烟草、胡萝 卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达[2]。此法 的主要原理是在高压脉冲条件下，细胞膜上会出现 瞬时可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，籍 此导入DNA等遗传物质，达到转化的目的。激光 法同电击法类似，一定波长的激光聚焦后直径达 0.3~0.5微米时，高能量的激光束可引起细胞膜的可 逆性穿孔，短时间内又可自动修复，因而可利用激 光束将外源DNA导入到细胞中。Weber等利用此法 将荧光素酶基因导入油菜叶绿体中，Toper转化烟 草、中国的傅荣昭等转化小麦均获得成功[2]。激光 法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物，转化受 体材料广泛。但这种方法的效率低是显而易见的， 使用范围小，存在问题较多，发展缓慢。
PTGS起初发现是转基因与内源同源基因之间 的相互协同抑制，这是一种转录后反式失活， 被称为“共抑制”（co-suppression）[17]。共 抑制现象不能被认为是进入内源基因组的转 基因的单向沉默效应，而应该看作是内源基 因和转基因之间的相互协调作用。在转基因 植株体内，内源基因和转基因能合作产生异 常RNA或cRNA。当其含量超过阈值时，激活 mRNA的降解机制[11]，它与顺式失活类似， 也有基因的剂量效应[8]。
转基因植物的基因沉默总体分为两类： 转录基因沉默（transcriptional gene silencing TGS）和转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing PTGS）[21]。 PTGS 基因沉默的方式分为顺式失活、反式失 活和共抑制三种形式[15]。
当基因导入一个并不连续的但具有沉默的同源 序列的基因组时，活性的转基因也能失活和甲 基化[15]，这种现象被称为“异位反式失活” （ectopic transinactivation），它能影响在相同 启动子控制下的基因表达，即使是正在表达的 编码序列也不例外[15]。这种特性表明启动子对 这种转录沉默很关键，引发“异位反式失活” 可能依赖于沉默位点通过指导DNA—DNA配对 而干扰基因组其它位点，或者它可能涉及由沉 默位点产生的可扩散传播的RNA起作用，这些 RNA可通过RNA—DNA相互作用导致同源目标 位点的基因沉默和甲基化[20]。
1．5 农杆菌介导法 科学家们经过长期的研究发现，农杆菌中存在一 种环状的、大小约150~200kb的质粒（tumorinducing plasmid，简称为Ti质粒），植物肿瘤即 是有Ti质粒上的一段DNA引起的，它通过特定的 机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并 表达，从而引起肿瘤的发生，这段DNA特称为 T—DNA（transferred DNA）这是一种天然存在 的遗传转化体系。人们利用这种天然的遗传转化 体系将外源基因导入植物细胞，并利用植物细胞 的全能性，通过组织培养，由一个细胞或一块组 织再生成完整的转基因植株，此即农杆菌介导的 遗传转化（agrobacterium-mediated transfermation）
[18]
农杆菌Ti质粒的T—DNA中带有Onc基因 （致癌基因），它在植物细胞内编码植物 生长素和细胞分裂素，使受浸染的植物细 胞不受限制地增殖而致瘤。此外T—DNA还 编码Opine类化合物，作为农杆菌代谢地氮 源和碳源。Ti上的T—DNA是由两端两个不 完整的25个碱基对的顺向重复序列所界定， 由于T—DNA不含编码促使自身转移物质的 基因，故可将其上的Onc基因及其它不必要 的序列去掉，而插入要转化的目的基因序 列，从而达到既不致使植物致瘤而又能改 良植物的目的[18]。
农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优 点：操作简便不需特殊仪器，培养周期短； 技术最成熟，转化效率高；外源基因多以单 拷贝插入，稳定性好；可以利用不同的启动 子控制目的基因在特定的器官进行特异表达； 较少出现基因沉默现象[3，18]；可将较大片段 D NA完整地转移到植物基因组中等[10，14]。 不过由于T—DNA可以在植物染色体的任何 区域内插入，就有可能导致有益基因的插入 失活，因此外源基因插入问题尚有待于基因 转移技术的进一步完善[3]。特别是在禾本科 粮食作物的遗传转化方面还存在许多局限[18]。
2．2 转录后基因沉默（PTGS） 转录后基因沉默（PTGS）
转录后基因沉默可定义为转录能进行但mRNA不能 积累而发生的基因沉默。它也可分为转录后顺式失 活和转录后反式失活（共抑制）。迄今为止，已发 现多例转录后顺式失活[65]，各种文献报道的结果初 步表明，PTGS在单倍体和纯合体中发生的概率较杂 合体要高，表现出基因剂量效应；使用双增强子的 35s启动子比使用经典的35s启动子发生PTGS的频率 要高[6，7]。根据前人的研究结果，Dehio和Schell提出 了PTGS可能的分子机制——阈值假说（threshold hypothesis）：PTGS是因为转基因RNA的过量产生 造成的，当RNA超过了一定的阈值水平，通过 RNA—RNA相互作用和/或反义RNA（cRNA）引发 mRNA的不可逆降解。