HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断

HPV E6/E7mRNA 在宫颈组织中表达，说明HPV 病毒表达出 癌基因活性。
bDNA技术原理
HPV 相关蛋白检测
人体的细胞周期包括G1，S,G2，M四个时相，且存在多个检 查点调节各时相点的转换及细胞周期进程。其中以G1→S期 最为重要，因为细胞一旦从G1期进入S期，则不再依赖外界 信息刺激而很快自动完成分裂过程，因此G1卡点可以决定 细胞继续增值或进入G0期或离开细胞周期进入终末分化或 死亡。 细胞周期卡点的转换受控于“细胞周期蛋白（cyclins）-细胞 周期依赖性激酶（cdks）-细胞周期依赖性激酶抑制因子 （clks）”这组分子网络。
①通过微小破损感染上皮组织。
②通过胞吞作用使整个病毒颗粒侵入上皮基底层细胞， 继而通过不明的机制被传送到细胞核。 ③正常情况下，病毒基因中的E1，E2，E4，E5低表 达，有利于病毒基因组的维持和细胞增生。表达水 平增高促进病毒基因组复制。
④随着宿主角质细胞开始分裂并逐渐分化为上皮表层， L1和L2蛋白表达促使病毒组装形成感染性病毒颗粒， 而E4高表达则使细胞胞浆破坏，凹陷，促进病毒释 放。
HPV分子生物学及宫颈病变病理诊断
彭振武 PZW7509@163.COM 广州安必平医药科技有限公司
一，HPV简介 二，HPV与宫颈癌的关系 三，HPV相关细胞学形态改变及判读要点
四，HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断
五，HPV疫苗的研究进展
（一）HPV简介
Human papillomavirus（HPV）
HC2结果判读：≥1.0pg/ml为阳性，相当于5000拷 贝。 如何正确理解HC2的检测结果？
PCR-RDB（分型检测）
DA8000全自动核酸分子杂交仪
HPV-DNA分型检测的临床意义？
① 能区分持续或反复感染。 ② 不同型别有不同的患病风险。 ③ 不同型别有不同的处理方案。 ASCCP2009版指南指出：≥30岁女性 细胞学阴性，而HPV16或18型阳性者，建议阴道镜检测。 细胞学阴性，其它HR-HPV型阳性者，一年后复查HPV-DN 和细胞学。
LSIL
ASC-US
ASC-US
ASC-US（可疑HPV一过性感染，无典型挖空表现） 细胞学诊断要点： 1.核有一定异型，有挖空趋势，但核周空晕不透亮。 2.成片聚集的表层细胞，核轻度增大或双核，可伴有 角化不全现象。
HSIL
HSIL（HPV病毒整合状态，持续性感染）
细胞学诊断要点：
1.高核浆比。 2.核的异型性，主要体现在核膜的不规则以及核染色 质增粗。
CIN3
CIN3
CIN3（ HPV病毒整合状态，持续感染，向宫颈癌进展）
组织学诊断要点： 1.核异型明显（肿瘤异倍体细胞的表现）。
2.中表层细胞出现病理性核分裂像。
3.全层细胞密度增加，极性紊乱，丧失正常的组织结构。 4.表层细胞不出现典型的挖空细胞形态。
（四）HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断
多数HPV感染并没有细胞学异常，大约只有30%的 HPV感染会产生相应的细胞病理学变化。 HPV引起的细胞学形态改变不仅仅表现挖空细胞特 征，还包括ASC和HSIL的病变特点。 挖空细胞只说明有HPV感染，但无法分清楚是低危 型还是高危型。 HPV分子生物学行为对应TBS报告术语。
典型的挖空细胞判读为LSIL，不典型的挖空细胞 判读为ASC-US或ASC-H.
人类染色体末端酶基因--hTERC基因
hTERC基因定位在3q26.3
hTERC基因的作用： 编码人类染色体端粒酶的重要基因， 影响细胞凋亡。
hTERC基因状态
影响
端粒酶活性
影响
端粒
与细胞凋亡密切相关
hTERC检测的意义
TBS分级
正常/炎症
ASCUS
ASC-H
LSIL
HSIL
TERC基因扩增发生率（%）
早期转录区
E5
E6 E7 L1
晚期转录区
L2 长控区 URR或LCR 调节基因转录
（二）HPV与宫颈癌的关系
宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，即高 危型HPV感染。 HPV感染普遍存在，但是引起的宫颈癌却相对少见。 高危型HPV总感染率大概在10%，15岁到25岁感染率 最高。 HPV感染平均为6-9个月，70%的HPV感染在一年内 清楚，两年内的清除率可达90%
⑥ E6，E7编码的原癌蛋白表达，导致人类染色体端粒体 酶逆转录酶基因（hTERC）扩增，维持端粒长度，细胞 永生，免于凋亡，发生癌变。
宫颈癌发生过程：
一过性HPV感染 HPV病毒 持续性HPV感染
中度细胞学异常
初次感染
进展 浸润
正常宫颈
清除
HPV感染的宫颈
逆转
癌前病变
宫颈癌
（三）HPV相关细胞学形态改变及判读要点
宫颈癌筛查最重要的目的是发现并且治疗那些经过 初筛发现异常，并最终活检确诊为高级别或以上的 病例。 宫颈病变LISL与HSIL的明确诊断，越来越有赖于多 种检测项目的联合应用及准确分析。
Kiቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ67
HPV分子靶向检测 hTERC: 宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中 几乎都伴有3号染色体长臂扩增。其中，涉及到的最 重要的基因可能是人类染色体末端酶（hTERC）基 因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿 瘤产生。现已得知，3号染色体长臂扩增能准确区分 宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，鉴别 诊断的敏感性及特异性均在90%以上
P16
P16
Cyclin D1： 1.在正常宫颈组织中低表达，在CIN和宫颈鳞癌中表 达增加并逐渐加强。 2.促进细胞周期紊乱，细胞异常增殖。CyclinD1过度 表达可能导致细胞G1期缩短，细胞过度增殖失控而 促进肿瘤的发生。
Ki-67: 1.在细胞周期的G1后期，S,G2，M期呈高表达，而在静止的 G0期细胞呈低表达。 2.Ki-67半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解，检测结果的可靠 性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原，是最能反映细胞增 殖状态的蛋白标志物之一。 3.Ki-67用于CIN的鉴别诊断，主要用于萎缩性病例，而对反应 性改变，化生性改变，修复性改变意义不大（细胞增殖指数 也很高）。
疫苗为无菌混悬液，需储存在2-8℃环境下，不能冷冻。
肌肉注射，注射后观察15分钟。
接种分三次进行（第一针,1或2个月后第二针，6个月后第三针） 对其它疫苗有严重过敏史的人或孕期女性禁用。 预防性HPV疫苗无法治疗已存在的病毒感染或相关病变。 治疗性疫苗需要进一步研制。
总结
HPV病毒与宫颈病变关系密切，不同程度的宫颈病 变其实就是HPV病毒感染机体后不同分子生物学行 为的表现，而病变的多样化与病毒型别，机体抵抗 力及个体差异相关联。
HPV致癌机制（整合状态）
① 高危型HPV病毒持续性感染。
② 病毒DNA与宿主细胞DNA发生整合，病毒与之整合的部 位位于E2编码区。
③ HPV整合导致E2片段缺失，失去了对E6，E7的正常调 控，导致其过度表达。 ④ E6与P53结合并使之降解，并能阻止和干扰细胞凋亡， 引起细胞无限增生并向恶性转化。 ⑤ E7与pRB结合，使E2F得以释放，从而使细胞周期由G1 期向S期转化，细胞周期失控而发生永生化。
TERC hTERC基因定位于3q26.3
hTERC基因检测（fish）
正常
扩增
（四）HPV疫苗
HPV流行病学
目前已分离出的HPV达100多型，其中至少14型可导致 宫颈癌。 16型与18型是最常见的高危型，大约70%宫颈癌由这 两种型别引起。 6型和11型是最常见的低危型，与90%生殖器尖锐湿疣 相关。 中国：HPV16（76.7%），HPV18（7.8%），HPV31 （3.2%），HPV52（2.2%），HPV58（2.2%）。
理解LSIL的定义，其实就是要弄清楚以下这个问 题：
组织学的CIN1指的是下1/3的细胞异型，而与之对 应的LSIL则是表层细胞形态的异常，如何解释？
LSIL
LSIL
糖原溶解细胞VS挖空细胞
LSIL（HPV病毒游离状态，一过性感染）
细胞学诊断的要点：
1.细胞成熟，为表层细胞来源。 2.核周空晕透亮，为胞浆塌陷或被破坏造成。
HPV基因组
E1
E2 E4
涉及病毒DNA复制，在病毒起始复制中起关键作用
抑制病毒转录复制，E2失活直接导致E6，E7过度表达
与病毒成熟胞浆蛋白有关，破坏胞浆中间细丝（纤 维）， 促进病毒颗粒释放 位于E2下游，通过细胞生长因子受体激活上调控
促进P53过早降解而抑制P53功能，并能阻止和干扰细 胞凋亡，引起细胞无限增生并向恶性转化 通过抑制pRB而消除细胞周期阻滞，导致细胞周期失控 而发生永生化 主要衣壳蛋白，LI:L2大约30:1 次要衣壳蛋白
HPV疫苗： 四价疫苗（6,11,16,18）
2006年6月，美国FDA正式批准美国默克公司生成的 四价预防性疫苗Gardasil的注册。
建议针对9-26岁的女性使用。在美国和其它部分国家， 该疫苗还被批准用于预防性男性生殖器疣。
二价疫苗（16,18）：
2007年注册的英国葛兰素史克生成的二价疫苗 Cervarix. 批准用于10岁以上的女性。尚未申请在男性中使用的 适应症。
HPV感染引起的低度病变（CIN1）不是癌前病变， 大多会自然转愈，对于任何致癌性HPV，诊断CIN1 并不意味着发展成CIN3的风险比活检阴性者高。 HPV病毒量的多少跟宫颈癌的发生有一定的相关性， 但是不成正比，不能预测疾病的进展。
有效预防HPV感染，就能减少甚至不得宫颈癌。
HPV自然生活史（游离状态）
HPV E6，E7 mRNA检测 HPV 的E6、E7是病毒癌基因，它们的翻译产物介导抑癌基因 p53和Rb的降解，从而干扰细胞周期调节。如若癌基因没有 表达，则细胞本身不会发生癌变。 E6蛋白能与细胞内 E6相关蛋白 ( E6 AP)形成复合物 ,特异性地 结合 p53,并通过依赖蛋白酶系统将其水解 ,使其对细胞生长 负调节功能丧失 ,从而引起细胞无限增生并向恶性转化。 E7蛋白是 HPV的主要转化蛋白 ,与控制细胞周期有关的肿瘤抑 制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb)亲和力极高 . E7与 Rb结合 使 Rb E2F复合物解离 , E2F被游离 ,从而发挥其转录因子的 作用 ,导致细胞周期失控而发生永生化。
研究最为广泛的一组是：Cyclin D1/cdk4/P16。P16在细胞周 期G1卡点中与CyclinD1竞争结合cdk4并特异性抑制其活性， 组织细胞尤其是带有损伤DNA的细胞进入S期，从而控制细 胞分裂。
P16： 1.在LSIL的敏感性和特异性为74%，在HSIL中则达到 97%以上。 2.在LSIL中的表达为点状，散在分布；在HSIL中的表 达为灶状，片状连续分布。
1.完整的病毒颗粒为一个 感染单位，外形呈20面体 对称型，外壳有72个衣壳 体。
2.HPV基因组为环状双链 DNA，含有近8000个碱基 对。分为早期区，晚期区 和长控区。
早期转录区：参与病 毒DNA的复制，转 录，翻译，调控和 细胞转化。
晚期转录区：编码病 毒的衣壳蛋白。 上游调控区：又称长 控区，通过与转录 因子的相互作用调 节早期区基因的转 录，参与病毒复制， 转录的调控。
HPV检测： 1.病毒DNA检测 2.病毒mRNA检测 3.病毒相关蛋白检测 4.病毒靶向检测
HPV-DNA检测
低危型HPV主要见于生殖器疣，常见的型别为6型和 11型。 高危型HPV与癌前病变和宫颈癌相关，常见的型别为 16型和18型。
检测方法有分型检测与不分型检测。
HC2（不分型）
操作步骤： ①裂解→②杂交→③捕获→④抗原抗体反应→⑤信号放大→⑥结果判读
4.6
13.5
28.6
25.2
87.7
病理分级
正常/炎症
CIN 1
CIN 2
CIN 3
原位癌
TERC基因扩增发生率（%）
4.2
7.3
69.2
85.1
95.7
LSIL与HSIL的辅助判断指标
ASCUS ASC CIN1 CIN1
CIN2/3
TERC 基因
49
宫颈脱落细胞FISH探针
CSP3
3号染色体着丝粒信号