第五章蛋白质代谢-折叠与加工

barnase 的折叠通过单一的的主 要过渡态，也就是通过一种主要途 径
Parallel folding pathways of Lysozyme
溶菌酶折叠经历不同的途径，两个主要一 个次要，分别为不同的熔球状态，在后 一阶段收敛到最后一个天然的状态。 α螺旋结构域形成高度的二级结构，β片层 结构没有检测到 αβ都没有稳定的结构域被检测 第三种状态不常被观测，αβ结构域都有明 显的构像单元
氨基酸序列决定三级结构
脲 巯基乙醇
A protein’s primary structure dictates its three-dimensional structure.
非折叠、变性的核糖 核酸酶的复性过程
Secondary structures Molten globules Subdomains Native structure
细菌--二硫键形成酶(Dsb) 、真核 --二硫键异构酶(PDI)
Post-translationally modified proteins may not readily renature
The C chain does not direct the folding of the A and B chains ,but, rather, simply holds them together while they form their native disulfide bonds.
proinsulin
insulin
Influence of S-S formation on folding
二硫键对折叠影响
天然牛胰胰蛋白抑制剂 和C14-C38二硫键还原、 羧基甲基化蛋白的热变性图
牛胰胰蛋白抑制剂
Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor
二、翻译后的加工
宇宙的年龄是〜 200亿年
蛋白质不可能搜索所有可能的构象
折叠过程为了在短时间内完成，必须接受某种引导，通过特定 的动力学途径，选择若干不稳定的中间体，而避免搜索大量的 不相关的构象
“Methinks it is like a weasel.”
Cumulative Selection
A few thousand
Proteins spontaneously fold into their native conformations under physiological conditions
模拟折叠途径
通过计算机模拟含有一个36残基结构域的蛋白质Villin 折叠途径. 在无数的可能性中， 对达到最终结构最有可能采取的途径作图时。 模拟折叠发生的理论时间跨度1微妙，然而计算需要在两台cray计算机上进行5亿个整 合步骤，每台连续运算2个月
两 类 分 子 伴 侣
Hsp70s 两个功能区：一个结合并水解ATP，一 个结合未折叠多肽链中疏水片段. 阻止蛋白质的变性和聚集 便于新合成多肽链的正常折叠
Human Hsp70 ATPase Domain Dnak Substrate Binding Domain In Complex With Substrate Peptide.
① 氨基的甲基化和乙酰化
蛋白质中氨基甲基化的例子不多. 已知有肌动蛋白中 His 残基N3 位的甲基化; 组蛋白中Lys 残基的ε 氨基甲基 化; 细胞色素c、钙调蛋白（calmodulin,CaM）的甲基化等。 Lys残基甲基化可消除正电荷. 蛋白质乙酰化十分普遍，估计体内80% 的 蛋白质有末端氨基的乙酰化 蛋白质乙酰化能延长蛋白质在细胞内存在的时间，而组 蛋白的乙酰化与染色质活化、染色质复制与组装、细胞分化 和细胞癌变等有关
原核生物的肽链，其N-端不保留fMet，大约半数蛋白由 脱甲酰酶（deformylase）除去甲酰基，留下Met作为第 一个氨基酸； 在原核及真核细胞中fMet或者Met一般都要被除去，由氨 肽酶（amino peptidase）水解来完成的。水解的过程有 时发生肽链合成的过程中，有时在肽链从核糖体上释放以 后。 至于脱甲酰还是除去fMet常与邻接的氨基酸有关
Electron micrograph-derived 3D image of the Hsp60 chaperonin from the photosynthetic bacterium Rhodobacter
蛋白质在伴侣蛋白内进行折叠和去折叠
sphaeroides
GroEL is a cylindrical structure
③ 磷酸化
蛋白质磷酸化是由蛋白激酶催化ATP 中的磷酸基 团转移到氨基酸残基的功能基团上。常见的磷酸 化修饰基团是Ser、Thr 和Tyr 羟基 蛋白激酶可分为三类： 1. 丝/苏氨酸蛋白激酶，如蛋白激酶 A （PKA）、 PKC、癌基因产物Raf 等（蛋白质的羟基被磷酸化 ） 2. Tyr 蛋白激酶（TPK），如生长因子受体、胰岛 素受体、Src 蛋白等（蛋白质的酚羟基作为磷受体 ） 3. 双功能蛋白激酶，如促分裂原活化蛋白激酶激酶 （MAPKK）
Post-translational modification
前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列 的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。 加工的类型是多种多样的，一般分为三种：
1. 2. 3.
N-端氨基脱甲酰化或fMet（Met）的切除 氨基酸侧链的修饰（化学修饰） 蛋白质的剪切/剪接
1．N-端氨基脱甲酰化或fMet（Met）的切除
熔球态
蛋白质折叠过程是以 等级方式进行的
自由能漏斗
Energy-entropy diagram for protein folding
通过细菌核糖核酸酶（Barnase）折叠中间体、过渡 态的平衡时的残基特征得到残基的详细信息
熔球中间状态的Barnase具有以下功能
具有大多数的天然状态的二级结构单元 α螺旋、β折叠的位置与天然结构类似 β折叠连的相对位置与天然结构类似
如果第二氨基酸是Arg，Asn，Asp，Glu，Ile或Lys以脱甲酰基为 主，如果邻近的氨基酸是Ala,Gly,Pro, Thr或Val则常除去fMet。
在细菌和线粒体中，甲酰基 是通过一种特殊的去甲酰化 酶（deformylase）产生一 个正常的NH2末端，若甲硫 氨酸是蛋白质N-端的氨基酸， 那么只需要这一步反应。约 有半数的蛋白质其末端的甲 硫氨酸再被氨肽酶 （aminopeptiase）切除掉， 产生一个新的R2末端。当 成熟肽链N-端的第一个氨基 酸不是甲硫氨酸时，这两步 反应都需要。
apical
150Å
顶部
140Å
intermediate
顶部 中间 赤道
equatorial
中间
Fra Baidu bibliotek
赤道
GroES 一个圆顶状结构
Reaction cycle of the GroEL/ES chaperonin system in protein folding
assist formation of proper S-S bonds during folding
溶菌酶平行折叠途径
Molecular chaperones: assistants of protein folding 结合到到一个折叠或聚集多肽在溶剂中暴露的 疏水性表面; 阻止蛋白质非法折叠或部分折叠的 ; 调整蛋白质折叠效率或将错误折叠的蛋白质转 化成天然构象 . •Heat shock proteins 70 (Hsp70) •Chaperonins
Folded conformation of the villin headpiece. Click to view a folding trajectory
Ten-microsecond MD simulation of a fast-folding WW domain. Peter L. Freddolino, Feng Liu, Martin Gruebele, and Klaus Schulten. Biophysical Journal, 94:L75-L77, 2008. Force field bias in protein folding simulations. Peter L. Freddolino, Sanghyun Park, Benoit Roux, and Klaus Schulten. Biophysical Journal, 96:3772-3780, 2009.
Levinthal 悖论
在折叠过程中，蛋白质能否探测每一种可能的构象？
If each peptide group has 3 possible conformations If a protein has 150 residues, then 3150 = 3.7 x 1071 If protein can "check" one possibility every picosecond Then, time to go through is 3.7 x 1071 x 10-12 = 3.7 x 1059sec (~1052 years)
第三节 蛋白质折叠与加工
一、蛋白质折叠
Protein Folding
Spontaneously With the assistance of enzymes With the assistance of chaperones
蛋白质的折叠
多肽链获得正确的三维结构，成为具有生物 活性的天然状态所经历的过程 有自发折叠、借助酶（二硫键）折叠，大多 数还需借助一类所谓的分子伴侣的蛋白质 分子伴侣结合到部分折叠的多肽链上，防止 它们同其他折叠或者部分折叠的蛋白质形成 不适合的缔合
变构效应和易位
蛋白质磷酸化的结果往往导致蛋白质变构和易位。变 构效应能调控酶的活性，而易位又使酶能到达底物分布的 亚细胞区域发挥其催化作用
广泛存在与时空分布
蛋白质磷酸化就整体而言广泛存在于几乎一切生命活 动中，但就个别蛋白质的磷酸化修饰有细胞周期特异性、 发育阶段特异性、组织特异性而呈现时空特异的分布。二 者结合在一起对生命活动进行更精确更有效的调控
② 羧基末端的酰胺化
蛋白质羧基端酰胺化能保护蛋白质免受羧肽酶降解 C terminus 是Gly 的蛋白质常被酰胺化。 分两步进行：先是Gly 羟基化，然后脱去一分子乙 醛酸并产生新的酰胺化C –terminus.
蛋白质— CO-NH-CH2-COOH 蛋白质— CO-NH-CH(OH)-COOH 蛋白质— CONH2+CHOCOOH
蛋白质磷酸化修饰及其对生理过 程调控作用的特点
可逆性
蛋白质磷酸化后可被磷酸酶水解除去磷酸基团而恢复原状， 所以磷酸化既有活化又有抑制效应
快速高效
磷酸化、去磷酸化均有酶催化，调控蛋白底物的活性，因 此快速、高效。但若磷酸化涉及转录因子及基因表达则效应 产生较慢但较持久
级联式反应
物质代谢途径和信号转导途径中往往有一连串的蛋白质磷 酸化，构成级联反应，从而产生放大效应，同时各级反应都 有可调控性
Hsp70在防止新生肽链和新释放的多肽链聚集和不正确折叠的作用
GrpE核苷酸交换因子
Hsp70在蛋白质中的折叠模型
Proteins can fold or unfold inside chaperonins 是一个大的复合物， Hsp60 由14 亚基构成，Hsp10由7亚基构成 行使功能需要ATP 非特异性 结合非折叠、部分折叠和不正确的 蛋白质，不接合天然状态蛋白质
2 氨基酸侧链的修饰（化学修饰）
细胞内几乎所有的蛋白质在核糖体合成后都 要经过共价修饰 蛋白质的共价修饰发生在肽链N-terminus 、 C-terminus或内部残基侧链的活性基团上 蛋白质的这种修饰作用能改变其活性、寿命 及细胞内定位
修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体蛋 白的Ser、Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基 化（如各种糖蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌 蛋白），乙酰化（如组蛋白），羟基化（如胶 原蛋白）。还有各种辅基如大卟啉环结合在叶 绿蛋白和血红蛋白上。 糖基化是真核细胞中特有的加工，这些蛋白常 和细胞信号的识别有关，如受体蛋白等