多糖类药物的质量标准研究现状及其进展

术 ,配合数码成像和数据处理 ,还可瞬间形成轮廓图
3 定量检测
谱 ,并给出各峰的积分值 ,加大了信息量 ,从而提高
311 直接测定多糖含量 多采用高效毛细管电泳 综合分析能力 。分离糖的 TLC 有硅胶色谱 、纤维素
法 、高效液相色谱法和酶法等进行多糖含量的测定 。 色谱 、硅藻土色谱及氧化铝色谱 。由于糖是多羟基
准
研 结构研究中 ,糖的核磁共振波谱主要是1 H、13 C 核磁 仪测定多糖含量 ,具有灵敏快速 、样品用量少 、精密
究 现
共振波谱 。多糖在1 HNMR 谱图上 ,大多集中在δ410
等优点 。
状
及 ～515ppm 范围内 。而13 CNMR 主要应用于多糖结构 316 石墨炉原子吸收光谱法 ( GFAAS) 如采用阿利
N AL
O
多糖作为药物 ,其质量直接影响药效的发挥 ,这 (Sephadex) 及琼脂糖凝胶 (Sepharose) 。
F Z
就要求建立稳定可靠的质量标准 。随着分析化学技 术的不断进步 ,中药的化学成分的研究手段与方法
112 膜分离法 膜分离是近年发展起来的超过滤技 术 ,不需加热和化学物质处理 ,不仅节约能源 、无环
度 ;采用醋酸纤维薄膜电泳检测鬼臼多糖及猴头多
西绿茶多糖[1] 的分离纯化 。 ②季胺盐沉淀法 : 酸性 糖的纯度 ;采用琼脂糖凝胶电泳检测西洋参多糖和
多糖能与其成盐形成不溶性化合物 ,可分离酸性及 鬼臼多糖的纯度 ; 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测西
中性多糖 。常用的季胺盐是十六烷基三甲基溴化铵 洋参多糖的纯度等 。
:
外光谱技术的发展及糖化学研究深入 ,红外光谱成 糖水解产物还原糖共热后还原成棕红色氨基化合
多 糖
为糖结构研究重要手段之一 。主要用于不同糖的鉴 物 ,于 540nm 处有特征吸收 。
类 药
别 、糖苷键及糖构型的确定 、糖键上主要取代基的识 314 重量测定法 先用 80 %的乙醇提取以除去单
IN ESE M
色较深 ,需要加脱色剂除去色素 。常用的脱色剂有 多糖 Hn 的纯度检查 。
ED IC
活性碳 、H2O2 等 。
超离心法 微粒在离心力场中沉降的速度与微 IN
E
脱蛋白 提取多糖时蛋白质常会一起被提取 , 粒的密度 、大小与形状有关 。如果某一多糖在离心
目前常用的脱蛋白方法有 Sevag 法 、三氯乙酸沉淀 力场作用下形成单一区带 ,说明微粒具有相同沉降
剂反应 (阳性) 、斐林试剂反应 (还原糖试验) 、双缩脲
滴定法 取多糖水解液 ,加入指标剂 ,滴定经标
试验 (阴性) 、碘 —碘化钾反应 ( 阴性) 、茚三酮反应 定过的溶液 , 根据样品水解液消耗体积 , 计算其含
(阴 性) 、三 氯 化 铁 反 应 、十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 量 。常用的滴定方法有斐林氏滴定法 、间接碘量滴
物 别[3]等 。常用的是将干燥的多糖用 KBr 压片法在 糖 、低聚糖 、生物碱等干扰性成分 ,然后用水提取其
的
质 400～4000cm - 1区间扫描做红外光谱分析 。
中所含的多糖类成分 。
量
标 213 核磁共振 (NMR) NMR 从 70 年代引入到多糖 315 生化分析法 将多糖水解 ,再用自动生化分析
陈
成分的定性定量分析 、杂质的限量检查和测定 、稳定
511 渗透压法 利用膜渗透压计测定范围在在 1 万
京 ,等
性考察等) 、中药的成分研究等方面都是重要的分析 ～50 万之间的多糖分子量 。采用渗透压法测定分子 :
手段 。HPLC 在多糖类药物中的应用主要在于多糖
量 ,要求样品内不含分子量小至能透过半透膜的物
浙江中医学院学报 2004 年 5 月第 28 卷第 3 期
多糖类药物的质量标准研究现状及其进展
陈 京 熊耀康(指导)
浙江中医学院 杭州 310053
JO
摘要 综述近 30 年来国内外在控制多糖类药物的质量标准中所用的方法和技术的研究现状及其进展 。
U R
关键词 多糖 质量标准 进展 综述
上进行分析检测 ,且它给出的是高分辨率的轮廓图 种方法如电子衍射 、旋光测定 、核磁共振等 ,但 X - 射
谱 ,重现性好 ,操作相对容易 ,而且是封闭系统色谱 , 线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前
在线操作外界影响小 ,色谱稳定性好 ,在线检测设备 确定多糖立体构型最为有力的工具 。
可选性较大 。因此 HPLC 在药品的质量控制 (如主要 5 分子量测定
比旋度法 不同的多糖具有不同的比旋度 ,在
N A L
法 、酶法 、盐析法 、微波提取 、超滤法及超声法等 。常
不同浓度的乙醇中具有不同溶解度 。故多糖水溶液
C H
用的提取溶剂有 :热水 、弱酸弱碱溶液及盐溶液等 。 脱色 经提取后得到的多糖大多因含色素而颜
经不同浓度的乙醇沉淀所得沉淀物 ,若具有相同比 旋度 ,则证明该多糖为均一组分 。如沙棘果水溶性
层色谱法对山茱萸多糖组成进行分析 。另外通过薄 层色谱扫描还可进行单糖组成相对含量的测定 。如 香菇柄水溶性多糖 LH - 2 单糖组成相对含量的测定 及单糖组成分析[7 ] 。
高效液相色谱法 ( HPLC) HPLC 是 60 年代末 70 年代初发展起来的一项新技术 ,具有分离效率高 ,分 析速度快 ,灵敏度高 ,易于实现自动化等特点 。中药 样品中含有的成分绝大多数均可在高效液相色谱仪
高磁场 NMR 方法能产生较完全和详细的结构信息 , 测定沉淀物中铜含量 ,间接计算 GAG含量[6] 。
并且可以在有或没有背景知识的情况下获得糖类比 4 多糖的结构分析
合物最完全的结构信息及其在溶液中或固态的行 411 糖的组成分析 多糖样品经水解进行单糖的组
为 ,同时还可通过计算机把样品的1 H 和13CNMR 谱数 成分析 。
413 X - 射线纤维衍射在多糖构型分析中应用 X - 射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合可以从原 子水平对多糖分子结构进行分析 。大多数多糖均不 能形成单晶 ,不适用于常规 X - 射线单晶衍射 。而 X - 射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了 越来越大的应用空间 ,再加上立体化学方面的信息 包括键角 、键长 、构型角和计算机模拟 ,就可以准确 地确定多糖的构型 。尽管研究多糖的立体构型有多
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浙江中医学院学报 2004 年 5 月第 28 卷第 3 期
化合物 ,极性强 ,容易吸附 ,多采用含有无机盐水溶 液制备硅胶薄板 ,使硅胶薄层吸附能力降低 ,斑点集 中 ,对分离有所改善 。因此薄层色谱分析技术在中 药检验和质量分析中已成为很常用的手段 。如用薄
描 、MS/ MS 方法 、不同衍生化处理 、同位素标记方法 、 GC/ MS 和 LC/ MS 以及各软电离技术的配合使用 ,质 谱法在糖的序列分析和结构鉴定研究中正越来越起 着重要作用[10 ] 。
糖和粘多糖 。吸附力一般随多糖分子中酸性基团的 峰 ,则表明为均一组分 。凝胶层析法可分为常压凝
增加而增加 。 ④凝胶柱层析 : 根据多糖分子的大小 胶柱层析及高效凝胶柱层析两种 。如鬼臼多糖的纯
和形状不同进行分离 。常用的凝胶有葡萄聚糖凝胶 度检查 。
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LL EG E
O
1 多糖的提取及分离纯化 111 常规分离法 包括提取 、除脂 、脱色 、除蛋白 、醇
同分子量和形状的物质通过的性质 ,多糖溶液通过 各种已知的超滤膜就能达到分离 。
F TR A D
沉 、柱分离纯化 、透析等基本步骤 。
113 纯度检查
ITIO
提取 目前常用的提取方法主要有温浸或煎煮
糖类化合物的 NMR 谱参照标准通常是四甲基硅烷 方法定量测定 。
(TMS) ,测定的溶剂多是中性或碱性重水 (D2O) ,但在 非质子溶剂如氘代二甲亚砜 、氘代吡啶中 ,可获得分
薄层色谱法 ( TLC) TLC 操作简单 、快速 、经济 、 可靠 ,且可同时鉴别多个样品 ,独具特色 ,与扫描技
辨率较好的谱图 。如山茱萸多糖的13C - NMR 。
H EJIA N
不断增加 ,使得当前建立现代化的中药质量标准成
境污染 ,且保留生物活性成分的高效价 ,因而得到广
G C
O
为可能 。本文就控制多糖类药物的质量标准中所用 的方法和技术的研究现状及其进展做一概述 。
泛的应用 。目前所用超滤膜是高分子材料制成 ,较 多为纤维素膜和聚砜膜 。不同的超滤膜具有允许不
据与数 据 库 信 息 进 行 比 较 来 确 定 糖 类 化 合 物 的 结
纸层析 将多糖溶于水后 ,点样于层析纸上 ,经
构 。此外 ,2D —NMR 、NOE 及15N 、31 P 的 NMR 数据对 展开显色后 ,与已知糖的斑点颜色及 Rf 值进行比较 糖链一级结构及其溶液构象的分析 , 也常被利用 。 而定性鉴定 ,或将斑点洗脱下来 ,用常用的微量分析
多 糖
含量的测定 、单糖组成分析及纯度检测 。
质 。如灵芝菌丝体多糖[11]的分子量测定 。
类
药
气相色谱法 ( GC) GC 测定糖类开始于 1958 512 蒸气压法 利用蒸气压渗透计测定范围在 500 物
的
年 ,具有高效 、高选择性 、高灵敏度 、用量少 、分析速 ～10000 之间的多糖分子量。如海星多糖[12] 的分子 质
法 、ZnSO4 沉淀法 、酶法及鞣酸法等 。 分离纯化 ①分部沉淀法 : 不同多糖在不同浓
度的低级醇或酮中具有不同溶解度 ,按比例由小到 大加入这些醇或酮 (常用甲醇 、乙醇和丙酮) 分部沉 淀 。适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖 。如广
速度 ,表明其分子的密度 、大小和形状相似 。
综
高压电泳法 多糖在电场作用下 ,按其分子大 小 、形状及其所带电荷的不同而移动的距离不同 。 如采用玻璃纤维纸电脉检测沙棘果水溶性多糖的纯 述
ห้องสมุดไป่ตู้
析出 。如沙棘果水溶性多糖 Hn 的纯度检查 。
物 。根据所用强酸和显色剂的不同 ,这类方法主要
光谱扫描法 采用紫外光谱在 180～640nm 波长 有 9 种 :2 %蒽酮硫酸溶液 、硫酸 ;二苯胺醋酸溶液 、盐
间扫描 ,在 260nm、280nm 处应无核酸和蛋白质的特 酸 ;间苯二酚乙醇溶液 、盐酸 ; 地衣酚乙醇溶液 、盐
其 进
分析 ,如异头碳的构型问题 、多糖残基中取代位置和 新蓝 (Alcian Blue) 与尿样中氨基多糖 ( GAG) 在 PH =
展
分枝点的确定 、多糖中各残基种类和比例[4] 的确定
518 的醋酸钠溶液中 ,发生沉淀反应生成 GAG 铜复
等 。与用于糖类化合物结构研究的经典方法相比 , 合物 。离心 ,分离沉淀物 ,以石墨炉原子吸收光谱法
纸层析法 取多糖水溶液点样于新华中速或慢 312 利用组成多糖的单糖的性质进行测定 其中利
速滤纸上 ,在室温下展开 ,显色 ,进行纯度检测 。如 用单糖缩合反应而建立的方法最多。
箬叶多糖[2]的纯度检查 。
显色剂 —酸法 多糖在酸作用下水解 、脱水生
冻融法 取多糖溶液经过反复冻融 ,应无沉淀 成糖醛类化合物 ,与酚类 、芳胺类等缩合成有色化合
征吸收峰 。
酸 ;80 %苯酚水溶液 、硫酸 ;2 %α- 萘酚乙醇溶液 、硫
2 定性检测
酸 ;色氨酸 、硫酸 ; 3 %水合 L - 半胱氨酸盐酸盐 、硫
211 理化性质 主要包括溶解性、硫酸2咔唑反应 酸 ;咔唑 、硫酸 。也有采用苯酚2硫酸法加酶联免疫测
(阳性) 、蒽酮 —硫酸试剂反应 (阳性) 、苯酚 —硫酸试 定仪快速测定多糖含量的 。
(CTAB) 及其碱 ( CTA - OH) 和十六烷基吡啶 ( CPC) 。
凝胶过滤法 由于凝胶具有一定大小的孔径 ,
③纤维素阴离子 交 换 剂 柱 层 析 : 常 用 的 交 换 剂 为 不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速
DEAE - 纤维素 。此法适合于分离各种酸性 、中性多 度不同 , 其流出液经示差检测仪检测 , 如只有一个
(CTAB) 络合反应 、比旋光度 、特性粘度 、电导率及 PH 定法 、氧化还原滴定法等 。如还原滴定法测香茹多
陈
值等 。
糖 、灵芝多糖 、螺旋多糖[5] 。
京 ,等
212 红外光谱 ( IR) 分析 上世纪 70 年代后 ,由于红
313 DNS 法 (3 ,5 二硝基水杨酸比色法) 利用与多