精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定-最后
精氨酸激酶(AK)的提取与纯化
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
精氨酸酯酶的分离与纯化
进行 皮下注射 ，４ｈ后将 小 白鼠处死 ， 去其 背部 的皮， ２ 剥 观
察 皮 上 出血 斑 情 况 。 ２５ 精 氨 酸 酯 酶 的 粗 提 【 二 乙 氨 基 乙基 葡 聚 糖 Ａ ５ ． 】 一Ｏ （ Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｅＡ ５ ） 层 析 洗 脱 液 在 紫 外 仪 器 ２ ０ ｔ Ｄ Ａ —ｅｈ ｄｘ －０ 柱 ８ ｉ ｍ
牛血清白蛋白（ 中科院上海生物物理所 生化厂 ） 。
２ 方法与结果 ２ １ 酶 活 力 测 定 【 以 Ｔ ． １ 】 ＡＭＥ为 底 物 ， 不 同 含 量 待 测 加
酶 液 ， ５ ０ｎ 处 测 光 密 度 。 在 ０ ｍ
２ ２ 蛋 白含 量 测 定 ． Ｆ ｌｎ酚 法 【 标 准 牛 血 清 白 蛋 白 稀 ｏｉ ｌ一 】
志 ，９ ５ １ （ ） ｉ一２ １９ ， ５ ３ ：ｏ１ ．
师范大学学报 （ 自然科学版）２ ０ ，７ ４ ：７８ ． ，０ ０ ３ （ ）７ —１ ［ ］ 中华人 民共 和 国 药 典． 部 Ｉ ］ 北 京： ４ 一 ｓ． 化学 工业 出版 社，
２ ０ ２ ７． ０ ５： ７
［ ］ 孔 婕 ， 健 ， 文 燕 ， ． 翘 挥 发 油 化 学 成分 的研 究 ［ ］西 北 ３ 姚 达 等 连 Ｊ．
一
定 神 经 毒 和 出 血 毒 ， 须进 行 再 次 纯 化 。此 方 法 重 复 操 必
作， ３ 得 批结果相近 的样 品， 将每次分得 的峰 Ⅳ冷冻干燥待
用。
１ 仪 器与材料
（） 器 ： Ｚ ０ —２型 紫 外 分 光 光 度 计 、＂ １仪 ＷＦ ８ ０１ ３ ＂ ２型 光 栅 Ｉ ２ 分 光 光 度 计 、 Ｇ３型 多 用 泳 干 燥 机 ；２ 药 品 和 试 剂 ： 白 Ｌ 一 （） 长 山 蝮 蛇 蛇 毒 （ 源 县 ） ＤＥ Ｅ Ｓｐ ａｅＡ一０ Ｓ Ｅ Ｅ 清 、 Ａ —ｅ ｈｄｘ ５ Ｗ Ｄ Ｎ Ｐ Ｒ ＨＡ ＭＡＣＡ 产 品 、 Ａ （ Ｉ Ｔ ＭＥ 中科 院 上 海 生 物 化 学研 究 所 ） 、
精氨酸酯酶的分离和纯化
１ ． ５抑 菌作用 比较方法 将 实验 用 肠 炎沙 门氏菌接 种 于ＭＨ肉汤 中 ，体 积 约为 ３ ｍＬ，在 ３ ７ ￣ Ｃ 环境 下培养 ｌ ８ ｈ ，并将菌液稀释 到浊度 １ ０ ５ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ ，然后使用二 倍 稀释法进行提取物 的体外抑菌实验 ，每个浓度 的实验均 重复３ 次。
酸性 氨基 酸及辅 氨 酸。蝮 蛇 中的 类凝血 酶 属胰蛋 白酶 家族 ，通过 切 除血 纤维蛋 白原的凝 聚 ，起凝 血作 用 ，但在体 内因它 不会 激活凝 血 因子
ｘ Ⅲ，所 以 由其 水解 产生 的纤 维蛋 白凝 块 的侧 链 不 能交联 ， 易被 纤 维蛋 白溶 酯降解 ，导致 体 内纤 维蛋 白浓度 下 降而表现 出抗 凝 效应 。
以Ｔ Ａ ＭＥ 为底 物 ，比较不 同含 量待测 酶液条件 下 ，在 ５ ０ ０ ｎ ｍ 处 测 光密度值 并记 录。见表１ 。
表 １ 酶 活 力 测 定
１材 料与仪 器 １ ． １实验材料 药 品和试 剂 ：长白山蝮蛇 蛇毒 、Ｄ Ｅ ＡＥ ． Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ ． ５ ０ Ｓ ＷＥ Ｄ Ｅ Ｎ
＜０ ． ０ ５ ，表 １ ）。
传统 的黄芩苷提取 方法 为水煮法 ，但水煮法 的提 取时间 比较长 ， 而 且提取率 比较 低。因此 ，为 了提 高黄芩苷的提 取率 ，笔者采 用最新 的超声提 取法 和传统 的水煮法进 行对 比分 析 ３ ］ 。研究结 果显示 ，超 声 法 提取黄芩 的抑 菌效果 明显优 于水煮法提取 的黄芩 ，超声法提 取黄芩 结晶物的抑菌效果明显优于水 煮法提取 的黄芩。 综上 所述 ，黄芩具 有 良好 的抑 菌作用 ，并且 使用超声法进 行有效
酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定
课程：实验日期：2012年月日专业班级：组别交报告日期：2102年月日姓名：学号报告退发：（订正、重做）同组者：教师审批签字：实验名称：酪氨酸酶的粗提取、分离纯化、纯度鉴定及活性测定实验目的：1.自行查阅资料，选取原材料，设计合理的酪氨酸酶提取、分离、纯化鉴定以及活性测定的方案；2.按照实验方案，自主进行实验并对实验方案进行评价和改进；3.通过酪氨酸酶的分离过程，了解并熟悉生物工程下游分离工程的一些常规操作；4.对实验结果进行总结，分析和汇总展示，培养分析问题和自我展示的能力。
实验原理：酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物体内。
与生物体黑色素的合成直接相关。
近年来，有学者已经从各种植物中提取得到酪氨酸酶，如马铃薯，蘑菇，香蕉，苹果，桑叶以及香樟等。
相关资料显示，L-多巴和邻苯二酚测定体系都说明香蕉，马铃薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性较高。
因此，本实验选取香蕉为实验原材料，通过简单的提取分离以及纯化，初步得到了酪氨酸酶的样品（溶液），并用邻苯二酚为底物对其活性做了定性鉴定。
酪氨酸酶的粗提取包括研磨（匀浆），过滤，离心，盐析和透析等过程。
盐析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。
随着溶液中离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。
同时由于盐的水化作用使蛋白质表面的疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出来，增大了蛋白质表面的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。
盐析的方法有K s盐析法和β盐析法，前者是改变体系的离子强度，而后者的则通过改变温度和pH实现。
由于蛋白质对离子强度的变化十分敏感，所以常采用K s盐析法。
常用的盐有硫酸铵等。
通过查阅资料，本实验中采用饱和度为55%的硫酸铵进行酪氨酸酶的盐析沉淀。
透析是一种膜分离的方法，利用的是浓度引起的自由扩散，在透析袋内盛放盐析后酪氨酸酶的溶解液，放入缓冲液内透析，目的是除去盐析过程带入的离子。
透析袋在使用前一般需要进行预处理。
生物化学真题及解答 考题分析
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c)指出哪一步对酶的纯化最无效。 d)表中结果能否说明该酶已被纯化?若估计酶的纯化程度还需要做些什么? e)若该单纯酶由 682 个氨基酸残基组成，该酶的分子量约为多少?(1997，北医) 考点：酶活力测定及酶的分离纯化。 解析：a)酶含量须用酶活力来表示，即在 1 分钟内转化 1 微摩尔的底物所需的酶量为一个 单位，而每毫克酶蛋白所具有的酶活力，称比活力，用单位 /毫克蛋白表示。 故每一步纯化程序后酶的比活性为 1.4000000〖〗20000＝200(U/mg) 2.3000000〖〗5000＝600(U/mg) 3.1000000〖〗4000＝250(U/mg) 4.800000〖〗200＝4000(U/mg) 5.750000〖〗50＝15000(U/mg) 6.675000〖〗45＝15000(U/mg) b)对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶愈纯，从第 4 步到第 5 步酶的比活力明显提高， 故亲和层析一步对酶的纯化最有效。 c)从第 5 步到第 6 步，酶的比活力无变化，所以第 6 步对酶的纯化最无效。 d)因为第 5 步和第 6 步的比活力一样，也就是说经过排阻层析后酶的纯度无变化，所以该 酶基本上已被纯化。 e) 一 般每个氨基酸残基含一 个氮原子，原子量为 14，而 每种蛋白质分子的含氮量都约 为 16%故，设蛋白质分子量为 x，则 14×682〖〗x＝16%，x=59675。 八、已知某多肽组成是 Ala5、Lys1，Phe1 与 2，4-二硝基氟苯(DNFB)反应后再酸解产 生一个游离的 DNFB-Ala，胰蛋白酶解得一个三肽：Lys1,Ala2 和一个四肽 Ala3、Phe1， 整个多肽经 糜蛋白 酶解产生一个六肽和 一个游离氨基酸，写出这个多肽的一级结构(1992 北医) 考点：氨基酸序列分析 解析：1.多肽与 DNFB 反应再酸解产生一个游离的 DNFB-Ala，说明此肽的 N 末端氨基酸 残基是 Ala。 2.胰蛋白酸水解 Lys、Arg 羧基侧的肽键，题中多肽无 Arg。且被此酸水解成一个三肽和一 个四肽，说明第 3 位氨基酸残基是 Lys。 3.糜蛋白酶水解 Phe、Tyr、Trp 羧基侧的肽键，此多肽中只存在 Phe，且被此酶水解成一 个六肽和一个游离氨基酸，说明其第 6 位氨基酸残基是 Phe。 4.此多肽一共有 7 个氨基酸残基组成 5 个 Ala，1 个 Lys，1 个 Phe，所以剩余的 2、4、5、 7 位全是 Ala。故此多肽一级结构为(从 N 端到 C 端)：Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Phe-Ala 九、磷酸酶、磷酸化酶、激酶、蛋白激酶有何区别?各举一例(1994 北医) 考点：对酶定义的理解 解析： 磷酸酶是将酶或蛋白质上磷酸基水解下来的酶， 如磷蛋白磷酸酶可将磷酸化的糖原合 酶上的磷酸基水解掉使其恢复活性。 磷酸化酶是将某一物质水解并将其磷酸化的酶， 如糖原磷酸化酶是在糖原分解过程中从糖链 上水解掉葡萄糖生成 1-磷酸葡萄糖的酶。 激酶包括多种，能将 ATP 磷酸基转移给接受体的反应都由激酶催化，如己糖激酶即可催化 葡萄糖生成 6-磷酸葡萄糖。 蛋白激酶也是激酶的一种，它多是在酶活性调节中发挥作用，将酶的丝氨酸、苏氨酸等残基 磷酸化，发挥共价修饰作用，使其活性升高或降低，如蛋白激酶 A 可将糖原合成酶磷酸化 使其失去活性。 十、从以下几方面对蛋白质及 DNA 进行比较(1999 北医)
精氨酸激酶(AK)
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
酶的提取综述实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景酶作为一种生物催化剂，在生物化学、医药、食品加工等领域具有广泛的应用。
酶的提取是研究酶性质和应用的基础，本实验报告对酶的提取方法进行综述，包括提取原理、常用提取方法、提取条件以及应用前景等。
二、实验目的1. 了解酶的提取原理和常用提取方法。
2. 掌握酶提取过程中的关键因素，如pH、温度、溶剂等。
3. 分析酶提取在各个领域的应用前景。
三、实验原理酶的提取原理主要基于酶的物理和化学性质。
酶作为一种蛋白质，具有特定的三维结构，能够在特定的条件下发挥催化作用。
酶的提取通常包括以下步骤：1. 细胞破碎：将含有酶的细胞或组织破碎，释放酶蛋白。
2. 酶的纯化：通过层析、离心、沉淀等方法，将酶蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来。
3. 酶的稳定化：通过添加稳定剂等方法，提高酶的稳定性。
四、实验方法1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：采用研磨、超声波等方法。
- 化学破碎：采用酶解、溶胀等方法。
2. 酶的纯化方法：- 离心分离：根据酶蛋白的密度和形状，通过离心分离。
- 层析法：根据酶蛋白的亲和性、电荷等性质，通过层析法分离。
- 沉淀法：通过改变pH、盐浓度等方法，使酶蛋白沉淀。
3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：如磷酸盐、糖类等。
- 调节pH和温度：保持酶的活性。
五、实验结果与分析1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：适用于酶蛋白含量较高的细胞，但可能导致酶活性降低。
- 化学破碎：适用于酶蛋白含量较低的细胞，但可能引入杂质。
2. 酶的纯化方法：- 离心分离：简单易行，但纯度较低。
- 层析法：纯度较高，但操作复杂。
- 沉淀法：操作简单，但纯度较低。
3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：能提高酶的稳定性，但可能影响酶活性。
- 调节pH和温度：能保持酶的活性，但可能影响酶的稳定性。
六、实验讨论1. 酶的提取方法应根据酶蛋白的性质、含量、应用领域等因素综合考虑。
2. 提取过程中，应尽量减少酶的活性损失，提高提取效率。
德国小蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及免疫活性测定
德国小蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及免疫活性测定闫浩;夏立新;陈家杰;刘娇;邓志琼;易海涛;刘小平【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2011(29)3【摘要】目的克隆德国小蠊精氨酸激酶(arginine kinase,AK)全长基因,表达、纯化重组AK蛋白,并研究蛋白的免疫反应性。
方法提取德国小蠊总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,PCR克隆德国小蠊AK片段,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。
用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组AK蛋白的免疫反应性。
结果德国小蠊AK基因开放阅读框全长为1071bp,编码356个氨基酸,GenBank登录号为FJ514482。
与GenBank中已登录的德国小蠊序列(登录号为EU429466)比对,同源性达97.2%。
重组质粒pET-28a-AK在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为45 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得目的蛋白。
Western blotting分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫反应性良好。
结论成功获得德国小蠊精氨酸激酶全长基因,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。
【总页数】4页(P191-194)【关键词】德国小蠊;精氨酸激酶;过敏原;克隆【作者】闫浩;夏立新;陈家杰;刘娇;邓志琼;易海涛;刘小平【作者单位】深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所;中南大学湘雅二医院【正文语种】中文【中图分类】R384.9;R392.11【相关文献】1.家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析 [J], 王华兵;徐豫松2.朱砂叶螨精氨酸激酶基因的克隆与表达特征 [J], 王磊;黄体冉;李光栋;安祥顺;杨金;王晓;胡帅;王平平;陈青3.管氏肿腿蜂毒液精氨酸激酶基因的克隆与表达分析 [J], 张枝全;任雪敏;樊晓红;王俊;吴国星;刘乃勇;朱家颖4.斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析 [J], 孙杨; 陈琼; 胡妍月; 秦文婧; 黄水金5.美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定 [J], 陈家杰;夏立新;刘志刚;刘雯;吉坤美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验四 酶的提取及比活性测定
实验四酶的提取及比活性测定一．酶的提取、比活测定概论1．方法：酶的本质是蛋白质，酶的分离提纯方法常采用分离提纯蛋白的方法――即利用蛋白的理化性质进行分离，如：前面血清γ球蛋白的分离纯化。
一般采用：透析法，有机溶剂沉淀法（乙醇，丙酮等）、层析法，透析、离心、电泳等。
通常需要多种方法配合使用。
2．体液――直接提取酶组织细胞――先破碎，再用一定的试剂提取方法3．原则①制备的原料必须新鲜，酶含量丰富，在提取过程中要保护酶的活性②初期采用粗而简单的方法，后期采用高分辨率而费时的方法③注意事项（影响因素）――回顾蛋白的变性因素ⅰPH：多数情况下酶作用的最适PH不一定是酶最稳定的PH,两者可能相差1个以上的PH单位。
根据不同的情况选择合适PH和合适缓冲容量的缓冲溶液，以稳定酶的活性。
ⅱ温度： 0℃，酶比较稳定。
提取酶的操作在0－4℃进行。
如果用有机溶剂沉淀法应先将有机溶剂预冷，例外：丙酮酸羟化酶，26℃时最稳定，有些酶低至－20℃或－70℃才能保留其活性，有些酶溶液经冻融处理十分有害。
ⅲ氧化：－SH（巯基）对有些酶的活性所必需，若被氧化，形成－S－S－（二硫键），酶活性丧失。
为防止失活，可加入还原剂：β－巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、半胱氨酸、谷胱甘肽等ⅳ重金属离子的污染：－SH可被Pb、Fe、Cu等重金属离子起作用而失活。
可加入1－3×10－4M的EDTA（乙二胺四乙酸）来螯合这些离子ⅴ蛋白酶的污染：细胞内蛋白酶释放，可能水解破坏酶。
可加入蛋白酶抑制剂，如：PMSF （苯甲基磺酰氟）、DFP（二异丙基氟磷酸）等。
ⅵ介质的极性和离子强度有些酶需疏水环境则加入1－10％甘油、蔗醣4．评估指标①酶的纯度――用比活性代表比活性：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位，随着酶的逐步纯化其比活性逐步升高，可借以鉴定酶的纯化程度和纯化步骤的正确性表示方法：每mg蛋白质具有酶的活性单位测定方法：ⅰ每ml样品中的蛋白质mg数ⅱ每ml样品中酶的活性单位酶活性单位:酶促反应在单位时间（秒，分钟，小时）内生成一定量的产物或消耗一定量（如1umol）的底物所需的酶量。
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
生产精氨酸工艺流程
生产精氨酸工艺流程生产精氨酸工艺流程精氨酸（L-arginine）是一种重要的氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等领域。
下面将介绍一种常见的精氨酸工艺流程。
首先，精氨酸的生产通常采用微生物发酵的方法。
选用产精氨酸能力强、耐高温、耐酸碱的微生物菌株，如大肠杆菌、蛮荒态放线菌等，以这些微生物为种子菌，通过菌种培养的方式扩大种群。
接下来是发酵过程。
首先，将选用的微生物菌种接入发酵罐中，在一定的培养基、酸碱条件和温度下生长和繁殖。
发酵罐中的培养基是由大豆蛋白、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾等原料按一定比例混合而成。
在发酵过程中，还需要控制培养基的pH 值、温度、氧气供应以及搅拌速度等因素，以保证微生物菌株的正常生长和产氨酸的效果。
随着发酵过程的进行，微生物会消耗培养基中的养分，同时产生精氨酸。
经过一段时间的发酵，发酵液中的精氨酸逐渐积累，达到一定的浓度后，可进行下一步的分离纯化工序。
分离纯化是精氨酸生产过程中的关键步骤之一。
一般采用离心、滤液、酸碱沉淀、透析等技术方法将发酵液中的粗制精氨酸与其他杂质进行分离。
其中，酸碱沉淀是一种常用的分离技术，通过调节发酵液的pH值，使得经过酸碱处理后，精氨酸以固体形式沉淀下来，悬浮液中的杂质则可被沉淀物分离开。
最后，对精氨酸进行精制和干燥处理。
这一步骤主要是通过蒸馏、结晶、洗涤、再结晶等工艺操作，去除其中的余量杂质，得到纯度更高的精氨酸产物。
将精制后的产物进行干燥，以降低水分含量，保证产品的贮存稳定性和品质。
在整个生产工艺过程中，需要严格控制各个环节的操作条件，保证菌种的活力和稳定性，控制发酵条件和分离纯化过程的技术参数。
同时，要做好卫生防护工作，确保产品的质量和安全。
总之，精氨酸的生产工艺流程主要包括菌种培养、发酵、分离纯化和精制干燥等步骤。
通过合理控制各个环节的操作，能够高效地生产出优质的精氨酸产品，满足市场需求。
《生物化学》第四节 酶的活力测定及分离提取
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反竞争反应模式
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反竞争性抑制的速度方程
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反竞争性抑制的双倒数图形特征
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反竞争性抑制的特点：
⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 分子结构类似；
⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制
第四节 酶的活力测定及分离提取
一、酶活力的测定 （一）活力（性）的表示方法 （二）测定 二、酶的分离提取
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一、酶活力的测定
（一）活力（性）的表示方法 １、活力—— v
测定酶活力就是测定酶促反应速度。 v ：单位时间内产物的生成量。
单位时间内底物的消耗量。
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2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位 时间内催化一定量的底物起反应所需的酶 量。 1 个酶活力单位（U） ，是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 微摩尔（μmol）底物的 酶量或是转化底物中1μmol 的有关基团的酶 量。
（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低， 但温度升高后，酶活性又可恢复。
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六、激活剂对υ的影响
能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激 活剂。 1、无机离子 阴离子 Cl－、Br－ ； 阳离子 H+
金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。 2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基
复合物结合，使酶的催化活性降低，称为 非竞争性抑制。
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反应模式
精氨酸激酶实验报告
一、实验目的1. 了解精氨酸激酶的基本性质和作用。
2. 掌握精氨酸激酶的活性测定方法。
3. 分析不同条件对精氨酸激酶活性的影响。
二、实验原理精氨酸激酶（Arginase）是一种非特异性酶，主要存在于哺乳动物细胞中，能够催化精氨酸与鸟苷三磷酸（GTP）反应生成鸟氨酸和焦磷酸（PPi）。
本实验通过测定精氨酸激酶催化反应的速率，来评价其活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 精氨酸激酶- 精氨酸- GTP- 磷酸缓冲液- 丙酮- 丙酮酸钠- 氯化钠- 氨水- 氢氧化钠- 硫酸铜- 氯化钡- 氢氧化钠溶液- 精氨酸激酶底物溶液- 比色计- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅2. 实验试剂：- 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）- 0.1mol/L GTP溶液- 0.1mol/L精氨酸溶液- 0.1mol/L丙酮溶液- 0.1mol/L丙酮酸钠溶液- 0.1mol/L氯化钠溶液- 0.1mol/L氨水溶液- 0.1mol/L氢氧化钠溶液- 0.1mol/L硫酸铜溶液- 0.1mol/L氯化钡溶液四、实验方法1. 配制精氨酸激酶底物溶液：- 称取一定量的精氨酸和GTP，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液中，配制成一定浓度的底物溶液。
2. 精氨酸激酶活性测定：- 取一定量的精氨酸激酶溶液，加入底物溶液，混匀后置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应。
- 在反应过程中，每隔一定时间取样，测定反应液中的GTP浓度。
- 通过比较不同时间点GTP浓度的变化，计算精氨酸激酶的活性。
3. 影响因素分析：- 研究不同pH、温度、底物浓度、酶浓度等因素对精氨酸激酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 精氨酸激酶活性测定结果：- 在实验条件下，精氨酸激酶的活性为X U/mL。
2. 影响因素分析结果：- pH：精氨酸激酶的最适pH为7.4。
- 温度：精氨酸激酶的最适温度为37℃。
- 底物浓度：在一定范围内，底物浓度越高，精氨酸激酶活性越高。
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。
食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。
水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。
锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。
本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。
首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。
兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。
通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。
测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。
序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均>90 %)。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。
3. 加样 打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一 层，然后加入酶液，加样量一般不超过凝胶体积的5%。
4. 洗脱与收集 打开恒流泵，控制流速进行洗脱，洗脱液通过 核酸蛋白检测仪并通过自动收集器收集，每管收集2min。
5. 收集目的蛋白 通过测定每个蛋白峰的精氨酸激酶活性， 确定目的蛋白所在的峰，收集，可通过离子交换层析进一 步纯化，直至达到单一蛋白峰。
80
8
60
6
protein content enzymatic activity
40
4
20
2
0
0
0
20
40
60
tube number
酶活力测定体系
分别取储备液即57 mmol/L 精氨酸、46 mmol/L ATP、66 mmol/L MgSO4 和指示剂 (包含 0.15% g/ml百里酚蓝和 0.025% g/ml 甲酚红) 各2 ml 加水到20 ml，调至pH 8.0 （575 nm下的吸收值在2.1 左右）。
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
❖ 实验目的 ❖ 实验原理 ❖ 实验材料、仪器和试剂 ❖ 实验操作步骤 ❖ 仪器使用 ❖ 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的tion Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
三、材料、仪器和试剂
1、材料 市售鲜虾肉 2、仪器 ① 层析柱（直径1.0-1.3 cm；管长30 cm) ② MC99-3自动液相色谱分离层析仪； ③ 核酸蛋白检测仪； ④ 自动部分收集器； ⑤ 分光光度计； ⑥ 低温高速离心机；
3、试剂 （1） 葡聚糖凝胶Sephadex G-100 （2） 精氨酸激酶提取液 （3） 凝胶层析柱平衡液 （4） 凝胶层析柱洗脱液 （5） 精氨酸激酶测定液
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
❖ 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? ❖ 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ ❖ 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ ❖ 4. 如何确定目的蛋白？ ❖ 5. 如何评价蛋白质纯度？ ❖ 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白质
含量和活性？