12维生素B12的吸收曲线绘制及注射液的含量测定

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新乡医学院化学教研室年月日

实验维生素B12的吸收曲线绘制及注射液的含量测定

一、实验目的

1. 掌握分光光度计的使用方法；

2. 掌握注射剂含量的测定和计算方法；

3. 熟悉测绘吸收曲线的一般方法。

二、实验原理

维生素B12是含Co的有机化合物，其注射液为粉红色至红色的澄明液体。要测定B12注射液的含量，可以用紫外－可见分光光度法测定，用此法进行含量测定，必须知道B12的λmax，λmax可以通过绘制吸收曲线来得到。

吸收曲线：将不同波长的单色光依次通过被分析的物质，分别测得不同波长下的吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标所描绘的曲线。吸光度最大时对应的波长为λmax，在λmax处测吸光度。B12在278，361，550nm处有最大吸收，在λmax处测得A，根据吸光系数法可以求出注射液中B12的含量。

吸光系数法：A=Ecl

E为207。

实验中要求测361nm处的A，相应的吸光系数%1

1cm

三、仪器与试剂

752型紫外－可见分光光度计，10mL容量瓶，5mL吸量管；0.1g·L-1维生素B12水溶液，维生素B12注射液(市售品)。

四、实验步骤

1．752型分光光度计的使用

（1）开启电源开关，使仪器预热20分钟。

（2）用波长选择旋钮设置所需的分析波长。

（3）将装参比溶液的比色皿置于光路，打开样品室盖，调节T旋钮，使显示器指针指在“0.00％”。

（4）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，调节A旋钮，使显示器指针指在“100.00％”。

（5) 重复操作(3)和(4)，直至仪器显示稳定。

（6）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，进行测定，在显示器上读出A。

（7）仪器使用完毕，关闭电源，拔下电源插头。取出比色皿，洗净、晾干。复原仪器，盖上防尘罩。

2．吸收曲线的绘制

将0.1g·L-1维生素B12溶液置于1cm比色皿中，以蒸馏水为空白溶液，在不同波长(340nm~580nm之间，其中从350nm~370nm和540~560nm每间隔5nm测量一次，其余每间隔20nm测量一次吸光度)下测量相应的吸光度。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘出吸收曲线。从吸收曲线上得到最大吸收波长，从而选择测定维生素B12的适宜波长。

3．注射液含量测定

避光操作。准确吸取0.50ml 维生素B 12注射液于10ml 容量瓶中，加水定容至刻度线。然后将溶液置于1cm 比色皿中，在361nm 波长条件下以蒸馏水作为空白测定吸光度，按C 63H 88CoN 14O 14P 的吸收系数%11cm

E 为207计算维生素B 12标示量的百分含量。

计算公式：

%100/1001%1112⨯⨯⨯）标示量（稀释倍数标示量％＝mL g E A V cm B 五、注意事项

1．在每次测定前，首先应做吸收池配套性试验。即将同样厚度的4个比色皿都装相同溶液，在所选波长处测定各比色皿的透光率，其最大误差∆T 应不大于0.5%。

2．仪器在不测定时，应随时打开暗箱盖，以保护光电管。

3．为使比色皿中测定溶液与原溶液的浓度一致，需用原溶液荡洗比色皿2~3次。

4．比色皿内所盛溶液以超过皿高的2/3为宜。过满溶液可能溢出，使仪器受损。使用后应立即取出比色皿，并用自来水及蒸馏水洗净，倒立晾干。

5．比色皿一般用水荡洗，如被有机物污染，宜用HCl －乙醇(1+2)浸泡片刻，再用水冲洗，不能用碱液或强氧化性洗液清洗。切忌用毛刷刷洗，以免损伤比色皿。

6．λ＜350nm 时使用氢灯，λ＞350nm 时使用钨灯。

六、思考题

1．单色光不纯对于测得的吸收曲线有什么影响?

2．利用邻组同学的实验结果，比较同一溶液在不同仪器上测得的吸收曲线有无不同。试作解释。