引物设计的要求(总结版)

引物设计

1. 引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman ）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2. 引物长度一般在15~30 碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp ，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm 值最好接近72℃。

GC含量（composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大（约1度）。有效启动温度，一般高于Tm 值5~10℃。Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4. 引物3′ 端要避开密码子的第3 位。

如扩增编码区域，引物3′ 端不要终止于密码子的第3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5. 引物3′ 端不能选择A，最好选择T。

引物3′ 端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′ 端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’ 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过3 个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G 值不要过高（应小于4.5kcal/mol ）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′端和中间△G 值应该相对较高，而3′端△G 值较低。

△G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G 值相对较高，而3′端△G 值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易

在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G 值可以用Oligo 6软件进行分析）

9. 引物的5′ 端可以修饰，而3′ 端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR ，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

引物设计要求简洁版

1) 避免重复碱基，尤其是G.

2) Tm=58-60度，一般为72度。

3) GC=30-80%，一般是45%-55%。

4) 3' 端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6) PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp 之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp ）。

7) 引物的退火温度要高，一般要在60度以上，一般为72度。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在，而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组污染的影响。

如果要扩全长，可直接抄写引物，长度大概为20个碱基。5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。