实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验120120页PPT
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若统计学上差异有显著性，但无剂量—反应关系，则 须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。
小白鼠的染色体分裂相（2n＝40）
小白鼠的染色体
试验设计
实验动物 7～12周龄健康雄性小鼠，每组保 证至少5只存活
剂量分组 – 阴性对照组 溶剂 – 阳性对照组 丝裂霉素C 1.5～2mg/kg 腹 腔 注 射 一 次 ； 或 环 磷 酰 胺 40mg/kg ， 腹腔注射，1次/d，连续5天。
试验设计
－剂量组 高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻 微中毒，体重略有下降，不引 起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组
3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻 分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴 管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～ 40min（低渗时间依室温条件而定）。
4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液 10mL，固定20min。必要时可存放在冰 箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉， 再加入新鲜固定液，固定10min。
目的
本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效 应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体 哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评 价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可 能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方 法的基本操作步骤。
原理
不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性 不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情 况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复 制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初 级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后 孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细 线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第12～14 天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细 胞染色体畸变效应。
再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱
中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的
充分溶解。取出过滤，两周后使用。
试剂
0.04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱 保存;
低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼 酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml
60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml 固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用
滴片
预冷的玻片
7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液 中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓 冲液冲洗。晾干。
8、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、 分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细 胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中 期相的细胞进行观察。
9．观察 每只动物分析100个中期分裂相 细胞。
时现配, 400ml;
百度文库
试剂
磷酸盐缓冲液（pH 6.8） 12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二钠： 4.74g） 磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 加蒸馏水至 1000 ml
Giemsa应用液: 取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲 液混合而成，临用时配制。
5、软化 吸净固定液，加60％冰醋酸2mL， 滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液， 用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/ min离 心10min。
6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.5～ 1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液 均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散 平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气 干燥或微热烘干。
仪器和器械
生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊 子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心 管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻 璃染色缸、擦镜纸等。
试剂
姬姆萨（Giemsa）染液
Giemsa染料
3.8 g
甲醇
375 ml
甘油
125 ml
配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔
细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，
接触途经 与实际接触途经一致或接近， 可一次接触，也可每天接触一次，连续5 天的方法。
取样时间 各组均于第一次接触后第12～14 天将动物处死采样。
操作步骤
1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射 秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g）
2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧 睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有 适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污， 转入另一小平皿中 。
（1） 裂隙、断片、缺失、微小体、环状 染色体、整倍体和非整倍体改变等。 （2）相互易位 涉及非同源染色体间末 端断片的交换，需要两次断裂和修复。 （3）X-Y和常染色体的单价体
结果评价
统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸 变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别 按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计 分析。 阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比， 统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量—反应 关系或在一个受试样品组出现染色体细胞畸变数明显 增高。
小白鼠的染色体分裂相（2n＝40）
小白鼠的染色体
试验设计
实验动物 7～12周龄健康雄性小鼠，每组保 证至少5只存活
剂量分组 – 阴性对照组 溶剂 – 阳性对照组 丝裂霉素C 1.5～2mg/kg 腹 腔 注 射 一 次 ； 或 环 磷 酰 胺 40mg/kg ， 腹腔注射，1次/d，连续5天。
试验设计
－剂量组 高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻 微中毒，体重略有下降，不引 起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组
3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻 分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴 管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～ 40min（低渗时间依室温条件而定）。
4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液 10mL，固定20min。必要时可存放在冰 箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉， 再加入新鲜固定液，固定10min。
目的
本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效 应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体 哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评 价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可 能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方 法的基本操作步骤。
原理
不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性 不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情 况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复 制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初 级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后 孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细 线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第12～14 天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细 胞染色体畸变效应。
再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱
中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的
充分溶解。取出过滤，两周后使用。
试剂
0.04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱 保存;
低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼 酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml
60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml 固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用
滴片
预冷的玻片
7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液 中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓 冲液冲洗。晾干。
8、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、 分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细 胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中 期相的细胞进行观察。
9．观察 每只动物分析100个中期分裂相 细胞。
时现配, 400ml;
百度文库
试剂
磷酸盐缓冲液（pH 6.8） 12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二钠： 4.74g） 磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 加蒸馏水至 1000 ml
Giemsa应用液: 取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲 液混合而成，临用时配制。
5、软化 吸净固定液，加60％冰醋酸2mL， 滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液， 用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/ min离 心10min。
6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.5～ 1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液 均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散 平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气 干燥或微热烘干。
仪器和器械
生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊 子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心 管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻 璃染色缸、擦镜纸等。
试剂
姬姆萨（Giemsa）染液
Giemsa染料
3.8 g
甲醇
375 ml
甘油
125 ml
配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔
细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，
接触途经 与实际接触途经一致或接近， 可一次接触，也可每天接触一次，连续5 天的方法。
取样时间 各组均于第一次接触后第12～14 天将动物处死采样。
操作步骤
1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射 秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g）
2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧 睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有 适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污， 转入另一小平皿中 。
（1） 裂隙、断片、缺失、微小体、环状 染色体、整倍体和非整倍体改变等。 （2）相互易位 涉及非同源染色体间末 端断片的交换，需要两次断裂和修复。 （3）X-Y和常染色体的单价体
结果评价
统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸 变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别 按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计 分析。 阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比， 统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量—反应 关系或在一个受试样品组出现染色体细胞畸变数明显 增高。