杂交瘤技术
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HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
18
HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
5
2、诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
6
（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和 副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用 最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促 进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生 抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代 意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。
3
一、细胞融合（cell fusion）
1、概述
细胞融合是指两个或更多个相同 或不同细胞通过膜融合形成单个 细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
4
两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。 基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体 通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单 核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。
11
电融合示意图
12
3、杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。
应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物 抗性标记、营养缺陷、温度敏感 等）。
13
HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径： 主要合成途径 补救合成途径
23
McAb技术的核心是用骨髓瘤 细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋 巴细胞融合得到杂交瘤细胞 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能 象骨髓瘤细胞那样在体外无限增 殖，又具有B淋巴细胞产生特异性 抗体的能力。
杂交瘤技术的基本过程
24
（二）杂交瘤技术产生的三个技术关键
1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性
16
H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
糖和
A
氨基酸
核苷酸 前体
T
TMP
TK HGPRT
H
IMP
核苷酸 DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
17
凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利 用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
19
由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。
20
二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
（一）基本概念
杂交瘤细胞 指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力， 又具有参与融合的体细胞的一些特征。
21
杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。
（2） 用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅 拌。
（3）继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与 PEG接触。
7
用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
8
（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜 之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融 合。
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效 率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
14
主要合成Biblioteka Baidu径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取 的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进 而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基， 因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
15
补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）， 将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。
存活但短命 死亡
存活
29
（三）单克隆抗体的制备过程
30
三个基本环节和两个决定因素
选
择 培
免疫鼠
培养筛选
取脾细胞 骨髓瘤细胞系
饲 养
养 基
细 胞
（HAT）
融合
31
1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一
般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。 免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液
46
12、杂交瘤抗体的贮存
因为反复冷冻和融化往往导致杂交瘤抗体变性，所以 对培养上清可加0.1%NaN3在4℃保存，对血清和腹水可以 小容量分装，冻存-70 ℃以下，在-20 ℃保存亦可。将它 们以硫酸铵沉淀物的形式（加等体积的饱和硫酸铵），保 存在4 ℃是一种节约、完全和长期贮存的方法。对纯化的 杂交瘤蛋白保存在4 ℃下，含0.1% NaN3的PBS中。
B淋巴细胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异 性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细 胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
25
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞。 没有抗体分泌。 经筛选HGPRTˉ或TKˉ。
26
2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
27
3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 筛选出
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞 骨髓瘤细胞
不能长期存活
28
HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩 大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、 变异及污染。
43
9、抗体大量生产
方法主要有两种： 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。腹水 可达每毫升几毫克抗体。
基喋呤），以后每3~4天换液一次。 （4）再维持培养两周改用一般培养液。
39
7、抗体的筛查
细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、 简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。
常用的方法有： ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等 McAb的检测。 RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 IFA用于细胞和病毒McAb的检测。 FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检 测。
9
10
（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电 场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
其优点是：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
35
4、 50%PEG配制
称20~50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃 瓶中，高压灭菌（121℃~132℃）20min，溶化 呈液状，PEG尚未凝固时，加入RPMI-1640 20~50ml（与PEG重量相当）立即充分混合。此 为50%PEG保存于室温，呈碱性，不必调节pH。
36
5、细胞融合
44
10、杂交瘤细胞的保存
因为细菌的污染和细胞的突变，使杂交瘤难 以维持，冻存几批早期杂交细胞，预防意外是必 要的。
无菌DMEM含20%牛血清加10% DMSO（二甲 基亚砜）配成冻存液，2×106~5×106细胞加入 1ml冻存液，于液氮中贮存。
45
11、细胞复苏
冻存管由液氮中取出，即刻投入37℃水浴中，很快 融化，用吸管吸出细胞到50ml离心管，内有50ml细胞生长 液，1000rpm ，10min，去上清，细胞沉淀物，再悬浮于 10ml生长培养液，室温静止10min，再悬于5ml生长培养液， 转移到25ml细胞培养瓶，置37 ℃ 5%CO2 孵箱培养，有些 细胞在复苏后1天左右即会死去。
杂交瘤技术
（hybridoma technique）
安徽医科大学微生物学教研室
1
内容纲要
细胞融合
概述 诱导细胞融合的常用方法 杂种细胞的筛选（HAT）
杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
基本概念 三个技术关键 单克隆抗体的制备过程
2
杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。 1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫
淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋 巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂 交瘤细胞系的技术。
22
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识
别一种抗原决定簇的均质抗体。 克隆
指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖 形成的细胞集落。
克隆培养方法
有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个 细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞； 亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。
软琼脂平板法 FACS选取法 显微挑选法
42
克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳 性克隆的筛查。
机制尚不明了，一般认为： 可能释放非种属特异性的生长刺激因子； 也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
34
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹 腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为 普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清 除死亡细胞及其碎片的作用。
饲养细胞的制备：
细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细 胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板， 每孔为1×105个，置37℃培养。
37
（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完， 并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。
（6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。
用于融合。
32
2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛 选）。 融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活 力细胞达95%。
33
3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨 髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数 分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加 入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。
40
8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系， 因此必需克隆化。一般需克隆化3~5次，才能获得稳定 型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。 分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染 色体丢失。
41
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞 数分别为2×105 和1×106 ）。
38
6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。 （3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
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HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
5
2、诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
6
（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和 副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用 最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促 进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生 抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代 意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。
3
一、细胞融合（cell fusion）
1、概述
细胞融合是指两个或更多个相同 或不同细胞通过膜融合形成单个 细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
4
两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。 基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体 通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单 核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。
11
电融合示意图
12
3、杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。
应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物 抗性标记、营养缺陷、温度敏感 等）。
13
HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径： 主要合成途径 补救合成途径
23
McAb技术的核心是用骨髓瘤 细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋 巴细胞融合得到杂交瘤细胞 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能 象骨髓瘤细胞那样在体外无限增 殖，又具有B淋巴细胞产生特异性 抗体的能力。
杂交瘤技术的基本过程
24
（二）杂交瘤技术产生的三个技术关键
1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性
16
H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
糖和
A
氨基酸
核苷酸 前体
T
TMP
TK HGPRT
H
IMP
核苷酸 DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
17
凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利 用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
19
由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。
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二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
（一）基本概念
杂交瘤细胞 指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力， 又具有参与融合的体细胞的一些特征。
21
杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。
（2） 用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅 拌。
（3）继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与 PEG接触。
7
用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
8
（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜 之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融 合。
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效 率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
14
主要合成Biblioteka Baidu径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取 的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进 而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基， 因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
15
补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）， 将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。
存活但短命 死亡
存活
29
（三）单克隆抗体的制备过程
30
三个基本环节和两个决定因素
选
择 培
免疫鼠
培养筛选
取脾细胞 骨髓瘤细胞系
饲 养
养 基
细 胞
（HAT）
融合
31
1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一
般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。 免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液
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12、杂交瘤抗体的贮存
因为反复冷冻和融化往往导致杂交瘤抗体变性，所以 对培养上清可加0.1%NaN3在4℃保存，对血清和腹水可以 小容量分装，冻存-70 ℃以下，在-20 ℃保存亦可。将它 们以硫酸铵沉淀物的形式（加等体积的饱和硫酸铵），保 存在4 ℃是一种节约、完全和长期贮存的方法。对纯化的 杂交瘤蛋白保存在4 ℃下，含0.1% NaN3的PBS中。
B淋巴细胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异 性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细 胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
25
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞。 没有抗体分泌。 经筛选HGPRTˉ或TKˉ。
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2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
27
3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 筛选出
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞 骨髓瘤细胞
不能长期存活
28
HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩 大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、 变异及污染。
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9、抗体大量生产
方法主要有两种： 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。腹水 可达每毫升几毫克抗体。
基喋呤），以后每3~4天换液一次。 （4）再维持培养两周改用一般培养液。
39
7、抗体的筛查
细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、 简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。
常用的方法有： ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等 McAb的检测。 RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 IFA用于细胞和病毒McAb的检测。 FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检 测。
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10
（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电 场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
其优点是：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
35
4、 50%PEG配制
称20~50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃 瓶中，高压灭菌（121℃~132℃）20min，溶化 呈液状，PEG尚未凝固时，加入RPMI-1640 20~50ml（与PEG重量相当）立即充分混合。此 为50%PEG保存于室温，呈碱性，不必调节pH。
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5、细胞融合
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10、杂交瘤细胞的保存
因为细菌的污染和细胞的突变，使杂交瘤难 以维持，冻存几批早期杂交细胞，预防意外是必 要的。
无菌DMEM含20%牛血清加10% DMSO（二甲 基亚砜）配成冻存液，2×106~5×106细胞加入 1ml冻存液，于液氮中贮存。
45
11、细胞复苏
冻存管由液氮中取出，即刻投入37℃水浴中，很快 融化，用吸管吸出细胞到50ml离心管，内有50ml细胞生长 液，1000rpm ，10min，去上清，细胞沉淀物，再悬浮于 10ml生长培养液，室温静止10min，再悬于5ml生长培养液， 转移到25ml细胞培养瓶，置37 ℃ 5%CO2 孵箱培养，有些 细胞在复苏后1天左右即会死去。
杂交瘤技术
（hybridoma technique）
安徽医科大学微生物学教研室
1
内容纲要
细胞融合
概述 诱导细胞融合的常用方法 杂种细胞的筛选（HAT）
杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
基本概念 三个技术关键 单克隆抗体的制备过程
2
杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。 1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫
淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋 巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂 交瘤细胞系的技术。
22
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识
别一种抗原决定簇的均质抗体。 克隆
指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖 形成的细胞集落。
克隆培养方法
有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个 细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞； 亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。
软琼脂平板法 FACS选取法 显微挑选法
42
克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳 性克隆的筛查。
机制尚不明了，一般认为： 可能释放非种属特异性的生长刺激因子； 也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
34
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹 腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为 普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清 除死亡细胞及其碎片的作用。
饲养细胞的制备：
细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细 胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板， 每孔为1×105个，置37℃培养。
37
（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完， 并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。
（6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。
用于融合。
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2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛 选）。 融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活 力细胞达95%。
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3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨 髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数 分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加 入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。
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8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系， 因此必需克隆化。一般需克隆化3~5次，才能获得稳定 型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。 分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染 色体丢失。
41
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞 数分别为2×105 和1×106 ）。
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6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。 （3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨