诊断酶学

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临床生物化学与检验
诊断酶学
林孟戈
本章学习过程中请你思考: 本章学习过程中请你思考 疾病时血清酶变化的病理机制有哪些? 1、疾病时血清酶变化的病理机制有哪些? 血清酶活性浓度的测定技术有哪些? 2、血清酶活性浓度的测定技术有哪些? 3、同工酶及其亚型的测定有哪些方法? 同工酶及其亚型的测定有哪些方法? 临床常用血清酶测定有何临床意义? 4、临床常用血清酶测定有何临床意义? 5、连续监测法测定酶活性浓度有何优点? 连续监测法测定酶活性浓度有何优点?
不加抗CK-MM血清时样品的CK活性:CK-MM和CK-MB活性; 不加抗CK-MM血清时样品的CK活性:CK-MM和CK-MB活性; CK 血清时样品的CK活性 活性 加入抗CK-MM血清时样品的CK活性:50%CK-MB的活性; 加入抗CK-MM血清时样品的CK活性:50%CK-MB的活性; CK 血清时样品的CK活性 的活性 加入抗CK-MM血清时样品的CK活性× CK-MB活性; 加入抗CK-MM血清时样品的CK活性×2:CK-MB活性; CK 血清时样品的CK活性 活性 所测CK-MM和CK-MB之总活性-CK-MB活性=CK-MM活性。 所测CK-MM和CK-MB之总活性-CK-MB活性=CK-MM活性。 CK 之总活性 活性 活性
第六节 同工酶及其亚型测定
一、概念
同工酶应是同一种属中由不同基因或等位基因所编 码的多肽链单体、纯聚体或杂化体, 码的多肽链单体、纯聚体或杂化体,具有相同的催 化功能,但其分子组成、空间构象、理化性质、 化功能,但其分子组成、空间构象、理化性质、生 物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。 物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。
2.间接法
(二)酶偶联反应
A
Ex
B
Ea
C
Ei
D
Ei——指示酶 Ei——指示酶 —— 工具酶
Ea——辅助酶 Ea——辅助酶 ——
酶学分析中作为试剂用于测定 化合物浓度或酶活性浓度的酶
wk.baidu.com
试剂1 试剂
试剂2 试剂
ALT(样品) (样品) LD(试剂) (试剂)
L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 丙酮酸 + NADH + H+
二、分类
单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、 单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因 决定的同工酶和修饰的同工酶等四类
三、分析方法
(一)电泳法---琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰 电泳法---琼脂糖凝胶电泳、 ---琼脂糖凝胶电泳 胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、 胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、 毛细管电泳 ● 用电泳法进行同工酶分析时,如显示的 用电泳法进行同工酶分析时, 区带数与同工酶数不一致时, 区带数与同工酶数不一致时,要特别注意 巨分子酶的存在。 巨分子酶的存在。 (二)层析法
三、酶的命名、分类与编号 酶的命名、
酶的命名---习惯命名法、 ---习惯命名法 ● 酶的命名---习惯命名法、系统命名法 酶的分类-----可分为六大类 ● 酶的分类---可分为六大类 氧化还原酶(oxido-reductases)、转移酶 氧化还原酶(oxido-reductases)、 (oxido (transferases)、水解酶(hydrolases) 裂解酶( (hydrolases)、 (transferases)、水解酶(hydrolases)、裂解酶(或裂 合酶)(lyases) 异构酶(isomerases) 合成酶( )(lyases)、 (isomerases)、 合酶)(lyases)、异构酶(isomerases)、合成酶(或连 接酶)(synthetases )(synthetases或 接酶)(synthetases或ligases) 酶的编号-----用 ● 酶的编号---用4个数字加以系统编号 第一个数字表示酶的类别,第二个表示亚类, 第一个数字表示酶的类别,第二个表示亚类, 第三个表示亚-亚类,第四个表示酶的编号序数。 第三个表示亚-亚类,第四个表示酶的编号序数。
习惯用名
乳酸脱氢酶 单胺氧化酶 γ-谷氨酰转移酶 (谷草转氨酶) 谷草转氨酶) 丙氨酸氨基转移酶 (谷丙转氨酶) 谷丙转氨酶) 肌酸激酶 碱性磷酸酶
英文缩写
MAO γ-GT/GGT (GOT) ALT (GPT) CK ALP(AKP)
EC编号 EC编号
1.4.3.4 2.3.2.2 2.6.1.1 2.6.1.2 2.7.3.2 3.1.3.1
第四节
酶活性浓度的测定技术
一、酶活性浓度测定方法
(一)按检测方法分类 (二)按反应时间分类 1、定时法 2、连续监测法 3、平衡法
二、连续监测法测定酶活性浓度
(一)连续监测法的种类 1.直接法
是在不终止酶促反应条件下, 是在不终止酶促反应条件下,直接通 过测定反应体系中底物或产物理化特 性的变化如吸光度、荧光、旋光性、 性的变化如吸光度、荧光、旋光性、 pH、电导率、粘度等, pH、电导率、粘度等,从而计算出酶 活性浓度。 活性浓度。 在原反应体系中加入另一些酶试剂, 在原反应体系中加入另一些酶试剂, 所进行的酶促反应和被测酶反应偶联 起来。 起来。
LD(LDH) 1.1.1.27 LD(LDH)
门冬氨酸氨基转移酶 AST
临床酶学分析中常用酶的名称与编号
第二节 血
一、血清酶的来源 1.血浆特异酶 2.非血浆特异酶 ①外分泌酶 二、血清酶的去路 1.血清酶的半寿期
清 酶
②细胞酶
2.血清酶的失活和排泄
三、血清酶变化的病理机制
(一)酶合成异常 1.合成减少 (二)酶释放增加 1.细胞内外酶浓度的差异 2.酶的相对分子量 3.酶的组织分布 4.酶在细胞内的定位和存在形式 (三)酶排出异常 2.合成增多
第五节 酶的免疫化学测定
一、测定原理 二、免疫化学测定的优缺点
优点主要有: 灵敏度高② 优点主要有:①灵敏度高②特异性高 ③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白 ④特别适用于同工酶的测定 局限性主要有:①制备足够量的提纯酶作为抗原和 局限性主要有: 具有免疫化学性质的抗血清较困难 ②测定步骤多,操作繁琐 测定步骤多, ③测定成本高
LD LD LD LD


正常和病理状况时血清CK同工酶谱 同工酶谱 正常和病理状况时血清
(三)免疫分析法
免疫抑制法 利用同工酶的一种亚基与相应的抗 体结合后,酶活性受到抑制,测定加与不加抗体前后 体结合后,酶活性受到抑制, 样品中酶活性的变化,可以计算出该型同工酶的活性。 样品中酶活性的变化,可以计算出该型同工酶的活性。
(一)系数K值的意义与设置 系数 值的意义与设置 (二)系数K值的类型与计算 系数 值的类型与计算
六、临床酶学测定的标准化
(一)标准化途径 1.使用推荐方法和参考方法 2.使用公认的酶校正物或酶参考物 (二)酶活性浓度测定的参考系统 1.建立原级参考方法 2.制备原级参考物 3.建立参考实验室网络
一、酶的组成、结构和功能 酶的组成、
酶是蛋白质,具有一、 三级结构, ● 酶是蛋白质,具有一、二、三级结构,有些酶还具 有四级结构。 有四级结构。 ● 单体酶(monomeric enzyme)---只由一条多肽链构成 单体酶(monomeric enzyme)---只由一条多肽链构成 --enzyme)-----由多个相同或不同 ● 寡聚酶 (oligomeric enzyme)---由多个相同或不同 亚基以非共价键连接的酶 多酶体系(multienzyme system)-----由几种不同功能 ● 多酶体系(multienzyme system)---由几种不同功能 的酶彼此聚合而成的多酶复合物 酶的必需基团(essential group)-----与酶的活性密 ● 酶的必需基团(essential group)---与酶的活性密 切相关的基团 酶的活性中心(active center)-----组成具有能与底 ● 酶的活性中心(active center)---组成具有能与底 物结合并起催化反应的特定空间结构区域
系统名
L乳酸:NAD+氧化还原酶 乳酸:NAD+氧化还原酶 单胺: 单胺:氧化还原酶 γ-谷氨酰肽:氨基酸γ-谷氨酰转移酶 谷氨酰肽:氨基酸γ L-门冬氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶 门冬氨酸: L-丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶 丙氨酸: 三磷酸腺苷: 三磷酸腺苷:肌酸转磷酸酶 正磷酸单酯磷酸水解酶
二、酶的催化作用机制
●酶主要通过与底物形成一种或多种中 间复合物来降低反应的活化能。 间复合物来降低反应的活化能。 ●在酶促反应中,酶与底物结合时,底 在酶促反应中,酶与底物结合时, 物首先和酶分子上的活性中心相结合, 物首先和酶分子上的活性中心相结合, 形成酶-底物中间复合物(ES), ),降低 形成酶-底物中间复合物(ES),降低 反应的活化能,显著提高了反应速度。 反应的活化能,显著提高了反应速度。
α-酮酸 酮酸 标本中 GLDH 标本中
α-丙酮酸 + L-谷氨酸 乳酸 + NAD+
340nm -△A/min


酶耦联法测定ALT 酶耦联法测定
(三)干扰因素
1.其他酶和物质的干扰 2.酶的污染 3.非酶反应 4.分析容器的污染 5.沉淀形成
三、血清酶活性浓度测定条件的优化
(一)方法选择 (二)仪器和设备 (三)试剂 (四)仪器参数的设置 1.方法类型 2.波长 3.样品量与试剂量 4. 稀释水量 5.反应时间 6.孵育时间 7. 延迟时间 8. 监测时间 9. 试剂吸光度上、下 试剂吸光度上、 限 10. 底物耗尽限额 11. 线性度 12. 试剂空 计算因子F 白速率 13. 线性范围 14. 计算因子F值 (五)标本的采集、运输与保存的技术误差因素 标本的采集、 1.溶血 2.抗凝剂 3.温度
四、血清酶的生理差异
1.性别 2.年龄 3.进食 4.运动 5.妊娠 6.其他
第三节 酶促反应动力学
一、酶促反应
二、Km与Vmax Km与 三、酶促反应进程
四、酶促反应的影响因素
1、酶浓度 2、底物的种类和浓度 3、缓冲液的种类、离子强度和pH 缓冲液的种类、离子强度和pH 4、温度 5、激活剂与抑制剂 6、其他
(二)酶活性浓度单位
以每单位体积所含的酶活性单位数表示。 以每单位体积所含的酶活性单位数表示。 1.表示方法---U/L 表示方法---U --2.酶活性浓度单位的计算---用连续监测法测 酶活性浓度单位的计算---用连续监测法测 --定时,根据摩尔消光系数计算。 定时,根据摩尔消光系数计算。
(三)参考值和正常上限倍数的应用
四、酶活性浓度的单位
(一)酶活性单位
1.惯用单位 2.国际单位---在特定的条件下,一分钟内使底 国际单位---在特定的条件下, ---在特定的条件下 物转变一微摩尔的酶量为一个国际单位。 物转变一微摩尔的酶量为一个国际单位。 3.Katal单位---在规定条件下,每秒钟催化转化 Katal单位---在规定条件下, 单位---在规定条件下 一摩尔底物的酶量。1katal=60× 一摩尔底物的酶量。1katal=60×106U
第一节
酶的概念与特征
一、酶的组成、结构和功能 酶的组成、 ● 酶的本质---绝大部分的酶是蛋白质,有些酶是核酸 酶的本质---绝大部分的酶是蛋白质, ---绝大部分的酶是蛋白质 和酶蛋白组成的复合体,极少数酶的本质是核酸。 和酶蛋白组成的复合体,极少数酶的本质是核酸。 酶的特性---极高的催化效率、 ---极高的催化效率 ● 酶的特性---极高的催化效率、高度的特异性 (specificity)以及催化作用的可调节性 (specificity)以及催化作用的可调节性 ● 酶的结构与功能 单纯酶 酶蛋白(apoenzyme) 酶蛋白(apoenzyme) 结合酶 辅因子(cofactor) 辅因子(cofactor) 辅基(prosthetic 辅基(prosthetic group) 辅酶(coenzyme) 辅酶(coenzyme)
1.参考范围 2.正常上限倍数的应用 正常上限(upper limits of normal, 正常上限(upper normal, ULN)倍数作为酶活性浓度的表示法, ULN)倍数作为酶活性浓度的表示法, 倍数作为酶活性浓度的表示法 就是测定值除以正常上限值。 就是测定值除以正常上限值。
五、系数K值的计算与应用 系数 值的计算与应用
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