基于PCR和位点特异性引物延伸反应的SNP检测方法的建立

基于PCR和位点特异性引物延伸反应的SNP检测方法的建立
单洪波1，金亚南2
（1. 杭州艾迪康医学检验中心，浙江杭州 310023；
2. 杭州优思达生物技术有限公司，浙江杭州 310053）
摘要：目的建立一种基于聚合酶链反应（PCR）、位点特异性引物延伸反应（ASE）和核酸试纸条检测技术的单核苷酸多态性（SNP）检测方法。

方法先通过PCR对包含SNP位点的特异基因序列进行扩增；然后通过带有A标记的ASE引物针对SNP位点的不同基因类型进行特异性延伸；延伸后的产物可以与B标记的探针进行杂交结合，形成同时携带A和B标记的杂交产物；而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测，从而完成对SNP基因型的检测。

结果通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA进行检测，PCR-ASE的检测敏感性为88 ng/反应；通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP位点2种不同基因型的检测，达到了多重检测的目的；PCR-ASE对19名志愿者的5个不同SNP位点的检测结果与基因测序法完全一致。

结论PCR-ASE 是一种简单、准确的SNP基因型检测方法。

关键词：引物特异性延伸反应；单核苷酸多态性；核酸试纸条检测技术
Establishment of PCR and ASE-based detection for SNP SHAN Hongbo1，JIN Yanan2. （1. Adicon Clinical Laboratories，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2. Ustar Biotechnologies （Hangzhou） Ltd.，Hangzhou 310053，Zhejiang，China）
Abstract：Objective To establish polymerase chain reaction（PCR），allele-specific extension（ASE） and nucleic acid detection strip-based detection for single nucleotide polymorphisms（SNP）. Methods The specific gene sequence containing SNP sites was amplified by PCR. For each SNP site，ASE primers labeled with A were extended. The ASE reaction products can bind to probe labeled with B，and hybridization products containing A and B simultaneously were formed. The products can be detected by disposable amplicon cross-contamination proof device containing a nucleic acid detection strip，and the detection of SNP genotypes can be accomplished.
Results Ten-fold serial dilutions of quantified human genomic DNA were used to determine the sensitivity of PCR-ASE（88 ng/reaction）. The ability of duplex PCR-ASE with the products can be detected by a single nucleic acid detection strip. A total of 19 samples representing 5 common SNP were detected by PCR-ASE，and the results had the consistency of 100% with DNA sequencing. Conclusions PCR-ASE is simple and accurate detection for SNP.
Key words：Allele-specific extension；Single nucleotide polymorphism；Nucleic acid detection strip-based detection
文章编号：1673-8640（2018）06-0530-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.06.015
单核苷酸多态性（s i n g l e n u c l e o t i d e polymorphism，SNP）是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在2种或2种以上不同的碱基，且其中任何一种等位基因在群体中的频率不<1%。

SNP是一种单碱基水平的分子遗传标记，不仅可通过连锁或关联分析来定位疾病易感基因，而且有些SNP本身就可能会导致某些疾病或引起个体对药物反应的差异[1]。

同时，SNP 图谱的建立还能有效地帮助破解人类生理学密码，了解人类进化的起源以及对患者进行有效的治疗[2]。

因此，SNP检测对疾病的风险性评估、诊断、预防和治疗等各方面均有很大的价值。

目前已报道了多种检测S N P的方法用于基因检测和药物基因组学的研究[1]。

引物特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）是目前比较常见的
作者简介：单洪波，女，1979年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。

物（PF 和PR ）、ASE 引物和探针均购于生工生物工程（上海）有限公司；引物和探针的有关信息见表1。

ASE 引物和探针的二级结构以及相互之间的杂交关系可通过Integrated DNA Technologies 公司的引物设计软件（http ：///pages/scitools ）进行分析，以避免假阳性的出现。

在针对不同SNP 位点进行检测时，需设计2条PCR 外围扩增引物，其退火温度为66～76 °C ；相关的ASE 引物的5'端需标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ，FITC ）或者地高辛（digoxin ，DIG ），其退火温度为45～50 °C 。

同时为了增加ASE 引物的反应特异性，可将SNP 位点设计在ASE 引物3'端的倒数第2位[11–13]。

整个PCR-ASE 扩增过程在Gene Touch （PCR ）基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）上进行。

Nanodrop 2000微量分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific 有限公司。

PCR-ASE 产物检测所需的核酸试纸条和全封闭式靶核酸扩增物检测装置均购自杭州优思达生物技术有限公司。

一种SNP 检测技术，具体指通过设计针对不同SNP 位点基因型的特异性引物达到特异性扩增和检测的目的[3-4]。

改进的AS-PCR 也包括引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应（tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction ，T-ARMS-PCR ）[5-6]和温度开关（temperature-switch polymerase chain reaction ，TSP ）等[7-8]。

但目前这些方法的产物往往只能通过溶解曲线和电泳进行检测。

这些检测技术不仅需要比较昂贵的仪器，还容易导致扩增产物之间的交叉污染[9-10]。

鉴于SNP 检测的重要意义，本研究结合聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR ）和位点特异性引物延伸反应（allele-specific extension ，ASE ）的优点对有关SNP 位点的基因型进行检测，探讨PCR-ASE 在SNP 基因型检测方面的应用可行性。

1 材料和方法1.1 材料
Taq DNA 聚合酶以及所有的外围扩增引
表1　本研究所使用的引物、探针及相关序列
引物名称基因型
序列信息（5'～3'）
长度（bp ）
P53 282PF TCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAG 23P53 282PR CTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC 23P53 282-C G/A FITC-GCTTTGAGGTG c G 13P53 282-T FITC-GCTTTGAGGTG t G 13P53 282DP TCCCAGGACAGGCA-BIOTIN 14rs 6323PF GCGATCCCTCCGACCTTGACT 21rs 6323PR CTTCTTCCAGAAGGCCTCCTTG 22rs 6323-G G/T FITC-CCCATTGGAAG g C 13rs 6323-T FITC-CCCATTGGAAG t C 13rs 6323DP AGAGAGAAACCAGTTA-BIOTIN 16rs 4532PF GGTGGGGAGGACTCCTGGA 19rs 4532PR TGTTCGTATCCTCACTGCCTGT 22rs 4532-A A/G FITC-ATTCCCTGCTT a G 13rs 4532-G FITC-ATTCCCTGCTT g G 13rs 4532DP AGTCCTCATCTTCCT-BIOTIN 15rs 6318PF GCATGAGCAACGTATTGTGTATAAG 25rs 6318PR GACGATTGAAAGTGCTGGCCAG 22rs 6318-G G/C FITC-GGTTTGGCAAT g T 13rs 6318-C FITC-GGTTTGGCAAT c T 13rs 6318DP
CGTCTGGGAATTTGA-BIOTIN
15
注：PF 和PR 引物为不同位点的PCR 扩增外围引物；小写字母分别代表不同的SNP 基因型；P53 282-T 在参与多重PCR-ASE 检测时，其末端标记了DIG
1.2 方法
1.2.1 血液中人基因组DNA的提取对由杭州艾迪康医学检验中心在2016年9—12月所采集的来自19名不同志愿者的全血样本（1 mL），先采用蛋白酶K在56 ℃进行过夜消化处理；再采用酚氯仿抽提法提取人类基因组DNA。

所提取的人类基因组DNA可先通过Nanodrop 2000微量分光光度计对其浓度进行测量，然后放置在-80 ℃进行长期保存。

1.2.2 PCR-ASE和检测 PCR-ASE主要分为4个步骤：PCR扩增、ASE延伸、ASE延伸产物杂交和核酸试纸条检测。

（1）通过PCR外围扩增引物对包含SNP位点的靶模板在较高退火温度的条件下进行指数扩增（扩增步骤1），从而达到富集靶模板的目的；（2）在较低退火温度的条件下，只有当ASE引物与SNP位点基因型一致时，才能在DNA聚合酶的作用下进行线性扩增（扩增步骤2），从而达到特异性检测的目的；（3）ASE引物延伸所产生的单链产物可以与体系中的探针进行杂交，进而形成双标记杂交产物；（4）形成的双标记杂交产物可以通过核酸试纸条进行可视化检测。

见图1。

PCR-ASE的总反应体积为20 μL，成分分别为50 mmol/L KCl、
10 mmol/L Tris HCl（pH值7.6）、1% Triton X-100；dNTP（2 mmol/L）；Mg2+ 3 mmol/L；Taq DNA聚合酶 1 U；模板DNA 3 μL；外围扩增引物的浓度为0.2 μmol/L，而ASE引物和探针的浓度均为 0.1 μmol/L。

PCR-ASE程序为2个扩增步骤： 95 ℃ 5 min；然后在94 ℃ 30 s；66 ℃30 s的条件下运行40个循环（扩增步骤1）；接着在94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s的条件下运行5个循环（扩增步骤2）；最后在95 ℃放置5 min。

所得的反应产物按照核酸试纸条或全封闭式靶核酸扩增物检测装置所提供的说明书进行检测和判读。

如果核酸试纸条的质控线（生物素标记）和检测线（抗FITC或抗DIG抗体）上同时出现红色线条则为阳性；如果只有质控线上出现红色线条则为阴性；如果质控线和检测线上均无条带出现则认为该次检测无效。

在PCR-ASE 中，5'端FITC或DIG 标记的ASE探针会在DNA 聚合酶的作用下进行延伸（扩增步骤2）。

而延伸的单链产物会与3'端生物素标记的探针进行结
注：PCR 外围引物；探针；A ASE引物；
图1　PCR-ASE的原理图　
SNP基因型A
A
T
A
T
A
5'A
T
A
5'
5'3'
A
阳性
阴性
核酸试纸条检测
ASE延伸产物杂交
3'
A
A
G
C
G
ASE延伸（扩增步骤2）
PCR扩增（扩增步骤1）
C
G
C
SNP基因型G 合，形成同时包含生物素和FITC或DIG的双标记产物。

在检测过程中，该双标记产物会由于生物素与亲和素之间的作用，先与试纸条加样端上的亲和素标记的红色颗粒结合从而形成红色颗粒-扩增产物-FITC或DIG复合物，并最终会由于FITC和抗FITC抗体或DIG和抗DIG抗体之间的相互作用而被固定在检测线上，并使检测线显示出红色条带。

而当无扩增产物形成时，亲和素标记的红色颗粒将移动至质控线，并与质控线上的生物素进行结合。

1.2.3 多重PCR-ASE 在PCR-ASE中分别加入2种分别标记FITC和DIG的针对不同SNP基因型的ASE引物，然后按照1.2.2所述的条件进行反应。

所得的扩增产物需用2条检测线上分别标记了抗FITC抗体和抗DIG抗体的核酸试纸条进行检测。

在进行多重检测时，所采用的核酸试纸条可不包含质控线。

SNP基因型的检测结果可根据不同检测线上的抗体类型进行判读。

1.2.4 基因测序和敏感性检测为了检测PCR-ASE的反应敏感性，先通过Nanodrop 2000微量分光光度计对人类基因组DNA（纯合子）浓度进行测量，然后对测量后的基因组DNA进行10倍系列的浓度梯度稀释，稀释得到的不同浓度梯度的样本再分别通过含不同ASE引物的PCR-ASE进行检测。

同时，本研究基因测序方法被用来验证PCR-ASE检测结果的准确性。

注：扩增步骤1和扩增步骤2的数量，1为20/25，2为25/20，3为30/15，4为35/10，5为40/5，6为45/0
图2　PCR-ASE 中2个不同扩增步骤数量对结果的影响
G A G A G A G A G A G A
1 2 3 4 5 6
ASE 引物基因型
质控线检测线
2 结果
2.1 不同扩增步骤循环数对PCR-ASE 的影响
由于PCR-ASE 中包含2个扩增过程，而2个扩增过程的目的存在很大的区别。

因此，为了验证2个扩增步骤中循环数的不同对结果的影响，本研究对2个扩增步骤中的循环数进行了相应的分配，然后用不同ASE 引物（A 型和G 型）对同一个纯合子样本（G 型）进行检测，见图2。

图2中扩增步骤1的循环数从20逐步增加到45，而步骤2的循环数则从25逐步减少到0，而总的循环数一直保持在45。

根据结果显示，总体来说随着扩增步骤2数量的减少，来自于A 型ASE 引物所导致的非特异性信号逐步减弱并最终消失。

当扩增步骤2的循环数>15时，A 型ASE 引物存在明显的非特异性信号。

而当扩增步骤2少于10个循环时，只有与模板基因型一致的G 型ASE 引物才出现阳性信号。

但是当扩增步骤2为0个循环时，2种ASE 引物的检测结果均为阴性。

2.2 多重PCR-ASE 检测
对多重PCR-ASE 所得的扩增产物需用不同检
注：（a ）多重PCR-ASE 对p 53基因282位点3种不同基因型的检测结果，1为G/G 纯合子，2为A/A 纯合子，3为G/A 杂合子，4为阴性；（b ）PCR-ASE 的反应敏感性检测，1~5的人类基因组浓度为8.8 ng/反应；（c ）p 53基因282位点3种不同基因型的基因测序结果，1为G/G 纯合子，2为A/A 纯合子，3为G/A 杂合子
图3　多重PCR-ASE 和敏感性检测结果
基因型G 基因型A
1
2
3
4
1
2
3
4
5
质控线检测线
（a ）（b ）
（c ）
测线上分别标记了抗FITC 抗体和抗DIG 抗体的核酸试纸条进行检测，检测结果见图3。

图3分别显示了p 53基因282位点3种不同基因型的检测结果G/G 、A/A 、G/A 。

如果只有上面或者下面1条检测线出现红色条带则分别代表该样本为纯合子G 和纯合子A ，而2条检测线上均出现条带的样本则为杂合子。

见图3。

2.3 PCR-ASE 敏感性检测和准确性的验证
对已知浓度的纯合子人类基因组DNA 进行10倍系列的浓度梯度稀释，然后通过相应的
PCR-ASE对所得的样本进行检测，结果见图3。

随着样本浓度的降低，检测线上的信号强度逐渐减弱，PCR-ASE的反应敏感性为88 ng/反应。

而当ASE引物与模板基因型不完全配对时，该梯度稀释的结果全部为阴性。

为了验证PCR-ASE检测结果的准确性，分别对19份临床样本的5个不同的SNP位点进行检测，并将其检测结果与基因测序法进行比较，符合率为100%。

见图3。

3 讨论
SNP是第3代遗传标记和目前生物学研究的热点，随着人类基因组学、药物基因组学以及精准医疗的发展，如何快速地对其进行有效的检测就显得尤为迫切[14]。

目前SNP的检测技术主要有基因测序、PCR-限制性片段长度多态性、高效液相、基因芯片等[14]，但是这些方法相对来说操作比较复杂，技术要求高，仪器设备昂贵。

这些特点在一定程度上限制了SNP检测的应用，特别是在一些发展中国家中的使用。

为了解决这一问题，我们开发了一种操作简单和技术要求低的基于PCR-ASE的SNP检测方法，其结果可通过核酸试纸条进行可视化检测。

PCR-ASE原理分别结合了PCR快速有效扩增靶基因和AS-PCR能对SNP不同基因位点进行区分的优点。

PCR-ASE先通过PCR外围扩增引物对包含SNP位点的靶模板在较高退火温度的条件下进行指数扩增（扩增步骤1），从而达到富集靶模板的目的。

而在此过程中，ASE引物由于其退火温度较低而无法参与到扩增步骤1中。

然后在较低退火温度的条件下，在已扩增的靶模板基础上，只有当ASE引物与SNP位点基因型一致时，其才能在DNA聚合酶的作用下进行线性扩增（扩增步骤2），从而达到特异性检测的目的。

在扩增步骤2中，由ASE引物延伸所产生的单链产物可以与体系中的探针进行杂交，进而形成双标记杂交产物。

而该双标记杂交产物可以通过核酸试纸条进行可视化检测。

为了验证PCR-ASE中的扩增步骤1和扩增步骤2对检测结果的影响，在维持总循环数不变的情况，逐步改变扩增步骤1和扩增步骤2 中的扩增循环数的分布。

在扩增步骤1循环数较少的情况下会导致有大量的外围扩增引物残留，而残留的外围扩增引物就会参与到扩增步骤2中。

根据以往的文献，由于Taq DNA 聚合酶保真度的问题，在退火温度较低的情况下，AS-PCR扩增过程存在一定的出错概率[13]，因此非特异性ASE引物在与模板不完全互补的情况下也可以进行结合并延伸，进而产生非特异性模板。

在步骤2循环数较多的情况下，该非特异性模板会在残留的外围扩增引物与非特异性ASE引物的共同作用下进行指数型扩增，最终导致假阳性的出现。

但是随着扩增步骤1循环数的增加，外围扩增引物会被大量消耗。

因此在进行扩增步骤2时，可有效避免外围扩增引物对扩增步骤2的干扰，ASE引物只能进行单链延伸反应，只起到一个线性扩增的效应，而无法对非特异性信号进行有效的放大。

同时随着扩增步骤2循环数的减少，可进一步抑制非特异性信号。

但是如果将扩增步骤2循环数降低为零时，由于ASE引物无法参与到扩增步骤1中，就会导致结果的假阴性。

为了降低PCR-ASE操作的复杂性，p53基因282位点3种不同基因型模板被用来对多重PCR-ASE的可行性进行验证。

当模板为杂合子时，2条检测线均出现了红色条带；而当模板基因型为纯合子时，只有1条检测线出现信号。

通过对已知浓度的人基因组DNA进行10倍系列的浓度梯度稀释，然后利用PCR-ASE 进行检测，结果显示P C R-A S E的敏感性为88 ng/反应。

同时为了验证PCR-ASE的准确性，分别对19份临床样本的5个不同的SNP位点进行基因检测，其检测结果与PCR-ASE结果完全一致。

这些结果均证明了PCR-ASE是一种简单、快速、结果准确可靠、适合于普通实验室开展的SNP基因型检测新方法。

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（本文编辑：范基农）。