脂肽初稿

脂肽类生物表面活性剂研究进展
沈玉江
（大庆华理能源生物技术有限公司，大庆163000）
摘要：脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂，在医药、食品、化妆品和微生物采油等方面有良好的应用潜力。

本文对脂肽的筛选、评价、提取、应用及展望等方面进行了综述。

关键词：微生物代谢产物脂肽生物表面活性剂
中图分类号：TQ016 文献标识码：A 文章编号：
Progress of Lipopeptide Biosurfactants
Abstract: The lipopeptide typically synthesized by microorganisms which is an important kind of biosurfactants,and it has a great potential in pharmaceutics,foods,cosmetic,oil recovery and many other fields.This paper reviews lipopeptide-producing,isolation and identification of the lipopeptide and its applications.
Key words:Miroorganism Metabolite Lipopeptde Biosurfactant
生物表面活性剂可分为6大类：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂。

脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，具有化学合成品很难具有的独特的两亲性分子结构，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成。

脂肽类生物表面活性剂不仅具有高效、低毒、无污染等优点，而且可以生物降解为无害产物，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景，已成为研究开发的热点。

1脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选及评价1.1筛选
脂肽产生菌的培养主要用富集培养法。

从油田的油土样和油水样中，经富集培养，血平板和油平板分离，液滴坍塌法、排油法和表面张力等法进一步复筛，再经过薄层层析(TLC)和红外光谱分析(FT-IR)鉴定，得到目的菌。

过去的筛选方法大都采用Mulligan等[1]发展的基于表面活性剂溶解血红细胞的特点进行菌株的分离，菌落周围的溶血圈的大小与微生物产表面活性剂的能力有关。

但该方法有局限性[2]：（1）不是非常专一，菌落周围的透明圈也可能是由于该菌产生的溶血酶造成的。

（2）以烃类为底物才能产表面活性剂的微生物不能筛选出来，因为烃类物质能与血红细胞发生反应，故该法只能用于筛选以非烃类为底物产表面活性剂的微生物。

（3）不产溶血酶的微生物也可能会由于表面活性剂在琼脂上的扩散限制而影响其筛选结果。

针对单一用血平板筛选的不足丁立孝等[3]们采用的多种方法结合法筛选到了8株细菌能够产生两类生物表面活性剂，均具有良好的表面活性，对59号菌株所产的脂肽表面活性剂进行了分离纯化，TLC和IR分析，并用氨基酸分析仪进行了氨基酸种类测定，该脂肽含有4种氨基酸，它们是Leu、Glu、Asp和V al。

刘飞等[4]通过原油富集初筛、排油圈复筛等方法，筛选得到了一株代谢产物具有表面活性的菌株RDY7-1，发酵液排油圈可达6.7 0cm且稳定。

结合菌株RDY7-1形态观察、生理生化试验和16SrDNA基因序列分析，初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifor mis)。

通过产物的带电性检测、产物酸处理前后硅胶薄层层析实验和氨基酸分析，可以鉴定产物为阴离子型的脂肽类表面活性剂。

据报道，脂肽类表面活性剂主要是由革兰氏阳性的芽孢杆菌产生的次级代谢产物[5]，可大致分为表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、地衣素(1ichenysin)、多粘菌素(polymi xin)等，地衣芽孢杆菌产生的脂肽类表面活性剂多为地衣素。

1.2评价
评价生物表面活性剂的表面活性可以
用空气与水之间的表面张力和油∕水界面间的界面张力来表示；或者用乳化液的不稳定性(破乳能力)和亲水-亲脂值(HLB)来表示；或者用生物表面活性剂的效率——临界胶柬浓度(CMC)来表示。

表面张力(空气／水)或界面张力(油∕水)用界面张力仪能够很容易的测定。

蒸馏水的表面张力是72mN／m，加上生物表面活性剂后表面张力可以降到30mN／m。

张翠竹等[6]从大港炼油厂污水中筛选到一株地衣芽孢杆菌NK-X3，在含糖培养基中培养可产生一种脂肽类生物表面活性剂，该生物表面活性剂在pH4-12的范围内和4000 mg/L的高钙离子浓度及15%的高盐浓度下仍维持原有表面活性更为显著的特点是在120℃的高温下不失活。

该产物可将水的表面张力由76.6降至35.5 mN/m。

其乳化活性值为 1.50，临界胶束浓度(CMC值)为30.0mg/L。

对高含胶质沥青质油的降粘率高达50%以上，增溶与脱附作用显著。

可使油水互溶而形成水包油型乳化小滴。

可使高含蜡油有效地乳化分散。

2脂肽生物表面活性剂的提取
目前，生物表面活性剂工业规模的应用与合成的表面活性剂相比并不具有优势，主要
是由于生物表面活性剂的生产费用较高，而产物的提取或称下游的处理费用占生产费的大部分[7]。

而且生物表面活性剂在发酵液中的低浓度和两亲性常妨碍其有效分离。

但随着研究的不断深入，传统方法的不断完善，新的方法也不断出现。

2.1萃取
溶剂萃取是一种常用的提取方法，被许多研究者所采用。

常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、戊烷、丙酮、氯仿、二氯甲烷，这些溶剂既可以单独使用，也可以混合使用。

氯仿和甲醇以不同比例的混合溶液是一种比较有效的萃取液，它可以使萃取剂的极性与目标提取物的
极性相协调。

Mata-Sandoval等[8]在对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos UG2)产生的鼠李糖脂(rhamnolipid)生物表面活性剂的提取过程中采用了氯仿-甲醇(2：1)的萃取剂。

取得了很好的效果，但对于大规模的生产来说，需要大量的氯仿做溶剂，这在经济上是不合理的，而且，氯仿是一种高毒性的有机氯化物，对人体和环境都有害，因此，寻找一种既便宜又低毒性的生物表面活性剂萃取剂是十分必要的。

Marias Kuyuklna等[9]对生物表面活性剂的萃取剂进行了研究，他们用甲基叔丁基醚萃取Rhodococcus产生的生物表面活性剂，通过和其它常用的溶剂相比较，认为用甲基叔丁基醚做萃取剂可以取得较高的产品产率(10g／L)，高效率(临界胶束浓度为130～170 mg／L)，同时产品具有良好的表面活性(表面张力和界面张力分别为29和0.9 mN／m)，甲基叔丁基醚具有低毒、可生物降解、易回收、不易燃及不易爆炸等优良特性。

因此，对于大规模的生物表面活性剂生产也是良好的萃取剂。

[10]
2.2超滤
超滤是用于从发酵液中提取生物表面活性剂的一种新方法，它是在压力的作用下让不易过滤的样品通过膜。

这种方法速度快、回收率高，在国外应用较为广泛[11,12,13]。

Sung-chyr Lin等[14]用分子量截止值(MWCO)为30，000Da的超滤膜对Bacillus licheniformis的变异体产生的生物表面活性剂进行了提取分析，同时还使超滤和高效液相色谱相结合，设计了一套对生物表面活性剂的提取、分析方法，由于生物表面活性剂在临界胶束浓度(CMC)以上时形成微胶束，使得超滤膜截取的分子量比生物表面活性剂的分子量大两个数量级，而向培养液中加入一定量的甲醇，胶束就会分散，生物表面活性剂就会通过滤膜，这样让原培养液、超滤滤液及在培养液中加入甲醇后的超滤滤液分别通过高效色相色谱，得到3张色谱图，在原培养液色谱图中出现的峰，如在滤液的色谱中消失，而在加入甲醇的滤液的色谱图中又出现。

则可证明这个峰是生物表面活性剂的峰。

而那些只在培养液的色谱图中山现的峰就不是生物表面活性剂的峰，这种方法可以排除生物大分子(如高蛋白质等)的干扰，因为生物大分子在甲醇的作用下不会裂解。

2.3泡沫分离
微生物的发酵过程中都会产生泡沫现象，产生表面活性物质的过程中尤其显著。

泡沫是由于快速搅动及向好氧微生物培养液中充氧而产生的，在表面活性物质存在的情况下稳定下来。

泡沫会使产品、营养成分及细胞流失。

为了抑制泡沫的产生就必须加入一些化学抑泡剂，这不仅增加了费用、减弱氧的传递，而且还会对微生物产生负面影响，但如果利用这些泡洙来回收表面活性物质，可能是一种既经济又合理的方法。

Davis 等[15]对这方面进行了研究。

他们用泡沫分离法对一类生物表面活性剂Surfactins进行了提取和浓缩，证明了泡沫分离是一种有效的生物表面活性剂分离方法，而且使泡沫分离和发酵过程相结合，建立了连续的生产过程。

3应用
生物表面活性剂结构的多样性决定了它的功能的多样性。

生物表面活性剂的应用价值业已得到了广泛的研究，生物表面活性剂在许多工业领域中有着广泛的应用，它们可应用于石油采收业、环境治理、农业、医药、纺织、食品和化妆品等众多工业领域[16,17]。

3.1微生物采油
自从Fleming发现微生物产生青霉素以来,微生物成为生物活性物质的一个重要来源,为天然合成化学品提供了丰富资源。

生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时,在其代谢过程中分泌出来的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖蛋白脂、脂肽、磷脂和脂肪酸中性类脂衍生物等[18]。

在油田开采中，经一次开采后，仍有大约70%的原油滞留在储油层中[19]。

强化采油可使采油率提高到80%-85%。

用生物表面活性剂驱油，不会对环境造成污染[20]。

由地衣芽孢杆菌NK-X3产生一种脂肽类生物表面活性剂，在pH为4～12和钙离子质量浓度为4000mg/L的条件下，于120℃高温下不失活，这些特点有利于该产品在原油的增采和输送中使用[7,21]。

王大威等[22]从大庆油田分离到的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZW-3代谢的脂肽生物表面活性剂的理化性质（CMC 值、乳化活性、对温度、矿化度的稳定性、降低油水界面张力能力）进行了测定，同时进行了物理模拟实验。

结果表明，该脂肽表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力，并可以适应油藏中复杂的环境，可提高采收率9.2％。

生物表面活性剂可促进原油从矿石、含有页岩断层的表面解吸附。

解吸附的范围和大分子量烃的浓度相反。

而且表面活性剂复合物还能够促进原油降解[23,24]。

微生物在油井内利用烃为碳源生长繁殖，能够产生表面活性剂、产酸、产气、产多聚物，从而促进原油从地底采初。

表面活性剂对长链烃的降解更显著，栳鲛烷和植烷类异戊二烯的降解程度和C17、C 18烃的降解一样。

3.2环境生物修复技术
用生物表面活性剂修复被烃类和原油污染的土壤是一种新技术25。

如用铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂清除了阿拉斯加砂砾层的大量的原油26。

在污染的砂土和泥浆中，加入铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂可使烃类的回收率大大提高，用铜绿假单胞菌产生的生物表面
活性剂处理砂士，可分别使脂肪族烃类和芳香族烃类的回收率达56％和73％27。

3.3 抗病毒作用
surfactin对脂包膜病毒的灭活比对非脂包膜病毒的灭活效率还高，尤其对疱疹病毒、逆转录病毒的灭活效率更高[28]。

它的作用机制是能与细胞膜上的磷脂(Phospholipids)相互作用
形成离子通道[29]，螯合一、二价阳离子[30]从而抑制了多种酶类如Cyclic AMP phosphodiesterase[31]和胞质PLA2的活性[32]；表面活性素还可以与病毒脂膜(Viruslipidmembrane)相互作用来破坏病毒脂膜和衣壳[33]，从而表现出抗病毒[34]、抗肿瘤[35]、抗支原体[36]、抗真菌[37]和一定程度的抗细菌[38]活性。

抗生素类Iturin具有广谱抑制植物病原菌的作用[39]，能够作为生物控制剂取代部分化学杀虫剂，能有效抑制病原菌对西红柿的危害。

不同的枯草芽孢杆菌菌株还能产生
杆菌抗霉素类似物，也具有强烈的抗真菌活性。

枯草芽孢杆菌B2菌株产生的脂肽类抗生素，用于防治大白菜软腐病和油菜菌核病，有很好的防治效果[28]。

3.4在农业上的应用
脂肽生物表面活性剂能选择性除去土壤中的Pb，Zn，Cu，和Cd等重金属离子[40]。

其中，Cu最易被除去，而且，NaOH或Na2CO3对于C u的除去有重要影响。

能够除去重金属离子的原因在于他们带有负电荷，能结合带正电的金属阳离子。

由地衣芽孢杆菌产生的脂肽地衣素能够和阳离子螯和[41]，且地衣素是比表活素更稳定的阳离子螯合剂，Lichenysin-Ca2复合物的个数比是2：1，即一个Ca2能结合两个地衣素分子，而Surfactin的结合比是1：1。

在农药污染的土壤中添加脂肽生物表面活性剂或培养表面活性剂产生菌，能显著降解有害成分。

在土壤中添加生物表面活性剂降解硫丹杀虫剂，可以使降解率提高30～45％[42]。

4展望
脂肽类生物表面活性剂由于其产量较低，生产成本较高，大规模的工业应用还未能实现。

随着生物技术的不断进步和生物工程的发展，人们对脂肽类生物表面活性剂尤其是对产生菌株的研究不断深入，有利于进一步认识脂肽的生产调控机制，进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺，有望在将来大规模应用具有商业价值的脂肽类物质。

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细菌产生的脂肽种类繁多、结构复杂。

即使具有同一基本结构的脂肽也存在多种结构类似物。

由于这些脂肽的结构相似,从细菌发酵液中分离纯化得到单分子化合物非常困难,这给进一步的结构鉴定带来困难。

脂肽结构鉴定的一个重点是肽链的鉴定,包括氨基酸的种类、比例和连接顺序等。

质谱技术的发展为肽链结构的鉴定提供了一种有效的方法。

利用两种重要的软离子化质谱新技术,即基质激光解吸附离子化质谱(MALDI-Ms)和电喷雾离子化质谱(EsI-Ms)技术,结合时间飞行质谱仪(TOF)或串联质谱(Ms-Ms),可以不需要分离混合物即可测定脂肽中肽链的结构[6]。

生物表面活性剂的研究在我国处于初级阶段,在发达国家也是新兴领域,其工业化水平较低,但有很大的发展潜力。

目前,化学家不仅更透彻地认识了合成天然产物的模块化细胞机制,并且已经利用代谢工程驾驭这些模块来制造全新分子。

相信随着研究的深入,生物表面活性剂可能不再作为助剂,而是作为有效成分得以应用。

脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，由于其独特的两亲分子结构和生物来源，使它们在研究应用方面受到重视，在许多工业领域有应用前景。

然而，由于其产量较低，生产成本较高，大规模的工业应用还未能实现。

随着生物技术的不断进步和生物工程的发展，对脂肽类生物表面活性剂的研究不断深入，尤其是对产生菌株进行分子生物学的研究，有利于进一步认识脂肽的生产调控机制，进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺，人们能够在将来大规模应用具有商业价值的脂肽类物质。