策划生物催化的第三次浪潮

策划生物催化的第三次浪潮

来源：生物谷日期: 2012年09月13日

生物催化是在合成化学中应用酶和微生物，将天然催化剂用于酶尚未进化到的新目的。经过几次技术研究和创新浪潮，生物催化领域现被证明已经达到了工业化水平。

第一次生物催化浪潮始于一个多世纪前，科学家意识到活体细胞的某些成分可以用于有用的化学转化（与此不同的是，发酵过程早已经成为常事上千年了）。比如，Rosenthaler使用从植物中提取的苯甲醛和氢氰酸合成了(R)-苯乙醇腈（维生素B17的有效成分之一），人们也已经知道微生物体内进行着甾体的羟基化反应。更近的例子是，蛋白酶被用于洗衣液中，葡萄糖异构酶被用于将葡萄糖转化为更甜的果糖，盘尼西林G 酰基转移酶被用于生产半合成抗生素。这些应用主要面临的挑战在于生物催化剂有限的稳定性，但这些缺陷首先由酶的固定化得以克服，该方法还易化了酶的重复利用。

第二次生物催化浪潮介于二十世纪八十至九十年代，最初的蛋白质工程技术，典型的是基于结构的，拓宽了酶的底物范围从而可以合成非常见的合成中间物上。这一改变使得生物催化扩展至药物中间体和精细化学生产领域。这方面的例子包括：脂肪酶催化拆分手性前体用于合成地尔硫卓（一种降压药）的手性前体，醇腈裂解酶催化合成除草剂的中间体，羰基还原酶催化合成纯化对映体醇用于生产降低胆固醇的沙汀类药物，脂肪酶催化合成酯化腊，如化妆品的添加物肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯或鲸蜡醇蓖麻油酸酯，腈水合酶（提取自玫瑰红红球菌）催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺用于形成聚合物。除了酶的固定化，现有的挑战还包括为非天然底物优化生物催化剂。

现在这第三次生物催化浪潮始于Pim Stemmer和Frances Arnold在二十世纪九十年代中后期的工作。他们开创性地借助分子生物学的方法通过体外版的达尔文进化快速而广泛的改变生物催化剂。现在这种方法通常被称为定向进化，尽管该词从1972年

的全细胞实验后一直在使用。这项技术最开始的做法包括：将蛋白质中氨基酸的随机突变通过重复循环累积起来，然后选择或筛选所得到的文库，最终得到稳定性更高、底物更专一、手性选择性更好的变体。我们在此讨论的接下来的改进将注意力集中在了提高定向进化的效率上，它们力求创造出更聪明的文库。工业规模的生物催化过程主要涉及到水解酶、少量酮还原酶、辅助因子的再生和蛋白质在有机溶剂中保持稳定。在一些实例中，代谢通路被优化。比如，将各种各样的天然菌种的基因结合后在新的宿主中生产1,3-丙二醇（聚酯纤维单体），这使得将给料从丙三醇变为更方便获得的葡萄糖成为可能。

由于目前这次生物催化浪潮所取得的进展，现在我们已经可以改造酶使其获得不同寻常的新的能力，比如接受先前为无效的底物（一种用于合成孟鲁司特的KRED，或者一种用于合成西他列汀的转氨酶）或者改变形成的产物的性质（适合不同萜的萜环化酶变体或氨基酸代谢生产作为生物燃料的乙醇）。今天，我们还需要新的酶用于将生物质能转化为第二和第三代生物燃料、材料和化学制品。使这第三次浪潮成为可能的关键的发展有：高级蛋白质工程（包括定向进化），基因合成，序列分析，生物信息学工具和电脑建模以及观念的进步（现在认为，酶的改进程度可以比之前所预计的更显着）。改造后的酶可以在含有有机溶剂的60摄氏度的溶液中保持稳定，可以接受新的底物，并可以催化新的非天然反应。这种改造可能现在只需耗时几个月，因此极大地扩展了潜在的应用。在过去，是围绕酶的缺陷来设计基于酶的流程，而现在，酶被人为改造以适合流程规范。

大约10年前，《自然》和《科学》上的文章回顾了第一和第二波生物催化浪潮并给第三次浪潮可能会带来什么以一窥。现在，正是评估这第三次浪潮所产生的影响并猜测下一个十年可能会带来什么的时候。尽管生物催化涉及代谢工程和合成生物学，本综述主要集中于酶和全细胞反应。

改造酶以适合生产流程

为了使成本最小化，化学生产需要稳定的，有选择性的，以及富有成效的催化剂，并且这种催化剂要在人们希望的流程条件下运作。要为这样一种流程改造酶，首先要定义设计目标，如增加稳定性，选择性，底物范围，或典型地，是它们的组合。在2000年，第三次浪潮之前，只有少数可用的策略来实现这些目标。酶的固定化可以增加蛋白质的稳定性，但是这只是适度地增加了稳定性，对大多数的化学转化而言通常是不够的。定向进化也是可能的，但依然很慢因为它需要构建和筛选大的文库，但文库所包含的大多数是退化的甚至无活性的变体。有猛烈进步的实例又很少与工业相关。这种缓慢的步伐意味着进化后的蛋白只包括少数改变，并且因此酶的性质也只是略微地改变了。尽管几百种酶促过程已经有工业用途，大多数涉及的酶和全细胞在遗传上只

是少量地被改变了。

在过去十年间，我们对蛋白质的认识和可用的定向进化的策略的数目都增长了，这使得对酶的性质作出大的改变成为可能。总的来说，酶工程将继续成为从众多可能的方法中选择其一加以应用解决手头的问题的案例研究汇总，而不是像土木工程，电机工程，软件工程或化学工程那样有一种定量的方法。将这些案例研究转化为改造原则需要使用自由能将设计目标与所需的结构改变结合起来。性质上大的改变需要大的自由能的改变。例如，稳定性上大的改变需要折叠－去折叠平衡中大的自由能的改变（即使是不可逆的蛋白质去折叠也起始于一种可逆的部分去折叠）。对蛋白质分子水平的理解提示了可被用于改进的策略。例如，负责折叠－去折叠平衡的表面残基以及向环内添加脯氨酸残基都将降低去折叠形式的熵。这些策略用更小更集中的蛋白质文库代替了大的随机变异的文库（大多数带有更劣质的性质），其中小文库含有很高比例的有活性且潜在可能已改进的变体。最后，通过估计各种各样的相互作用力的强度（表面离子对或添加一个脯氨酸残基对熵的贡献），研究者可以估计为达到目标所需作出的改变。现在，很少有研究者明确地使用基于自由能的测量来规划蛋白质工程的策略，但是将案例研究转化为工程原则则需要定量的方法。

新的改进的方法学

在过去的十年间，DNA技术和生物信息学的巨大进步为生物催化领域提供了关键性的支持。这些工具促进了从自然资源中发现新的酶并大大加速了对存在的生物催化剂的重新改造。

改良的DNA技术

下一代的DNA测序技术使大规模的平行序列分析成为可能，并且大幅度降低成本。尽管在2002年人类基因组序列分析的花费预计在大约70,000,000美元，到2012年其已缩水了1,000多倍，为少于10,000美元。LifeTechnologies, Illumina和Oxford Nanopore Technologies已宣布为在几个小时内测完整个人类基因组而设计的测序仪器在2012年晚些时候将可以实现，并且将会把每个基因组的成本降至少于1,000美元。来自不同环境的有机体的全基因序列以及环境中的DNA样品，其包括难以培养的生物（元基因组），创造了一种丰富的资源，使得可以并且将来也继续可以从中寻找新的生物催化剂。使用Illumina的大规模高通量（> 10,000,000基因序列）测序技术同样易化了探索和认知蛋白质序列－功能的相互关系。

低成本的DNA合成已代替分离基因组DNA作为蛋白质工程的起始点。全基因DNA

合成进一步允许为宿主生物优化密码子并在适宜的位点引入分子构筑结构如启动子、