生物药物分析与检验 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验

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多肽因子类和蛋白质类药
③检测或鉴定 NC膜借助非共价键吸附蛋白质，经转移 后蛋白质条带就固定在NC膜上，完全保留凝胶中的蛋 白谱，可直接用考马斯亮蓝、氨基黑10B等染色。 • 如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检 测，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血红蛋白，或 非离子去垢剂（0.3％吐温-20）等处理NC纸，以封闭 NC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。 • 使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NC纸上的某 些蛋白质洗掉，同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性 剂，
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二、多肽因子类药物的检查 1、分子量检查 • 常用还原型SDS-PAGE法检查分子量，用量约1μg。 • 也可采用凝胶过滤法，例如Sephadecx系列（G-75，100）；waters 1～60，125，250；Backman TSK 2000SW，3000SW，4000SW。 • 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDSPAGE是测定蛋白质亚基的分子量，同时用这二种方法 测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白 质是否是寡聚蛋白质。
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2、酸碱滴定法 • 谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸 • 赖氨酸（lysine）片中赖氨酸的测定 • 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相 当于赖氨酸 0.15g ）臵烧杯中，加水 25mL ，滴加氢氧 化钠滴定液（ 0.1mol/L ），用酸度计调节至 pH 值为 7.0，加入预先调节至pH值9.0的甲醛溶液15mL，搅匀 ，再用氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L ）滴定至 pH 值为 9.0，并持续30s。 • 按加入甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L） 体积计算，每毫升氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当 于9.132mg的C6H14N2O2〃HCl。
• 酪氨酸的max＝275nm • 苯丙氨酸的max＝257nm • 色氨酸的max＝280nm
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• 这三种氨基酸可以通过紫外 吸收光谱加以鉴别。 • 精密称取酪氨酸、色氨酸、 苯丙氢酸各适量。 • 用水制成每1mL含20μg（色 氨酸）、 40μg（酪氨酸） 、200μg（苯丙氨酸）。 • 在波长230～300nm测定各氨 基酸的吸收光谱，如右图。
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• 本层析系统中，由于分 离的程度与各种氨基酸 显出不同的颜色，可以 区别十一种氨基酸。 • 用茚三酮-硝酸钠试剂 亦能显出不同颜色的色 斑，且灵敏度较高。
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4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每 种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨 基酸药物的鉴别指标。
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3、非水溶液滴定法 • 中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药 物，除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法， 其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法。 • 用冰醋酸作溶剂，高氯酸作标准溶液滴定，电位法或 指示剂法确定终点。 • 适用于常量氨基酸的含量测定。
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②转移电泳 将湿醋酸纤维素（NC）薄膜紧贴凝胶，凝 胶与薄膜之间不能有气泡，否则在气泡所在部位的条 带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤 纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料 网框架夹紧，插入电泳槽，根据凝胶中样品所带电荷 的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极 一侧。 • 电泳条件取决于凝胶类型、转移装臵和蛋白质本身性 质等。一般采用低电压和低电流（2mA/cm2以内）。 • 缓冲液中一般含有20％的甲醇或乙醇，其作用主要是 保持凝胶的几何形状。
10 mL 25mg 加水定容至 混合待测液 1mL 分别2.5mg 加水定容至 各种对照液
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（ 3 ）点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各 3μL ，分别点于同一薄层板上。 • 以正丁醇 -水 - 异丁酸-醋酸（ 50︰ 50 ︰ 5 ︰7）之上层 作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必 须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。 • 喷以显色剂（吲哚醌 1g ，溶于 100mL 无水乙醇和 10mL 冰醋酸中）臵100℃干燥5～10min至显色完全为止。
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2、蛋白质免疫印迹电泳法（转移电泳、western blot） • 原理：借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高 效分离，分离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在 另一种固相载体（通常用醋酸纤维素薄膜，简称 NC膜 ）上，能保持原有的生物活性，可以进行各种生物检 测、免疫识别、扫描、积分和保存。
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三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 • 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 • 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧 化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成 还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分 子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的波 长为570nm。 • 茚三酮反应为一切α-氨基酸所共有，反应灵敏，根 据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。 • 本法可允许的测定范围是0.5～50μg氨基酸。
基本内容
第一节 第二节 第三节 氨基酸类药品检验 多肽因子类和蛋白质类药品检验 几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析
第一节
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• 氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的 一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值 的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。 • 目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创 制了一些新的生化药物。 • 如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤 • 氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征 • 偶氮丝氨酸治疗白血病 • 乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎
20 mL水
静置15 min
COOH
O OH
+ H-C-NH2
R
O
H O
+ NH3 + CO2 + R C
O
O
O
+ NH3 +
HO O O
N
H
C O
+ H2O
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2、光谱鉴别法 （ 1 ）紫外吸收光谱法 在 20 种天然氨基酸中，只有酪 氨酸、色氨酸和苯丙氨酸 在紫外区有最大吸收。
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二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 • 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类 的氨基酸。 • 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的 供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在 同一硅胶G薄板上，一般用正丁醇︰水︰冰醋酸（3︰ 1︰1）展开晾干后，喷茚三酮的丙酮溶液显色，规定 供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点， 以此限制其他氨基酸的含量。
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4、定氮法 • 精氨酸和天冬酰胺的原料及其制剂可以采用定氮法测 定含量。 • 将被测药物臵于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适 量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮 完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强 碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸 碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药 物的含量。
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茚三酮反应：茚三酮在酸性溶液中与α-氨基酸共热 ，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物 质。 mL水 mL茚三酮T .S . 3 min 5mg样品 5 1 加热
蓝紫色溶液
O OH OH O
O OH H O HO
第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验
• 蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具 多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。 • 多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极微 ，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。 • 其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介 素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产 的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫 苗等。
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• 氨基酸为白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解， 都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。 • 氨基酸在等电点（pI）时溶解度最小，最稳定。 • 中性pI值在5～6.3左右。 • 酸性pI值在2.8～3.2左右。 • 碱性氨基酸的pI值在7.6～10.8左右。
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（1）基本操作 分3个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳；转 移电泳（即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸 上）；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。 ①聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将待分离样品进行凝胶电泳 分离。 • 凝胶可用琼脂糖凝胶，也可用聚丙烯酰胺凝胶，可以 是均一的，也可用梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有 各种变性剂，如SDS、LDS、尿素等，可进行单向或双 向电泳，也可用等电聚焦电泳。
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2、等电点测定 • 等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带 电性质。 • 一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。 3、紫外吸收 • 不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种 蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。 • 紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。
一、氨基酸的定性鉴别 • 旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析 、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。 1、化学鉴别法 • 氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与 茚三酮显蓝紫色。 • 采用茚三酮显色法，中国药典（2010年）二部对所收 载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。
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• 5、HPLC • 对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前 较多地采用了高效液相色谱法（HPLC）。 • 因大多数氨基酸没有紫外吸收，不能用紫外检测器测 定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需 进行化学衍生化。 • 衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。 • 柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生； 柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC分 离。
第八章 氨基酸、多肽因子和 蛋白质类药品检验
• 基本要求：
• 掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及 安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因 子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检 查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法， 掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含 量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子 和蛋白质药物的质量分析过程。
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2、安全性检查 • 影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要 为热原的含量。 • 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。 • 采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体 内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定 供试品中所含热原的限度是否符合规定。
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1：酪氨酸 2：色氨酸 3：苯丙氨酸。
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（ 2 ）红外吸收光谱图 氨基酸在红外区都有特性图谱 ，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别 依据。 • 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相 互强度关系均应与对照的图谱一致。
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3、薄层色谱鉴别法 • 在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基 酸。 （1）薄层板的制备
mL无水乙醇， 2.5mL水 5g微晶纤维素样品20 拌成糊状
待用
均匀涂板
溶剂挥发完毕后
105C ,1.5h
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（ 2 ）十一种氨基酸混合液（色、蛋、亮、异亮、甘、 赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液的制备。
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多肽因子类和蛋白质类药
一、多肽因子类药物的定性鉴别 • 基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS-PAGE法 和免疫印迹法。 1、SDS-PAGE法 • 用SDS-PAGE鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对 照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标 准品有相同的迁移率，从而鉴别该品。 • 缺点：必须有标准品；凝胶中多肽需保留生物活性， 或能够复性，或电泳前可将检测配基与待测多肽共价 交联。