高效液相色谱法测定聚葡萄糖含量的研究_康琪

Table 2
表 ２ 葡聚糖标准品和样品精密度实验 Results of HPLC system precision for Dextran standard
聚葡萄糖（ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ）是一种可溶性膳食纤维，它 是由葡萄糖和少量山梨醇、柠檬酸经高温熔融，随机 缩聚而成的多糖，其分子量分布广（１６２～２００００Ｄａ），约 有９０％的聚葡萄糖分子量在５０４～５０００之间，平均聚合 度约为１２，平均分子量为２０００。聚葡萄糖含有的糖苷
键种类多，以１，６－糖苷键为主，分子结构比较复杂（如 表１ 所示）。由于聚葡萄糖不能被８０％ 的乙醇沉淀，所 以不能被膳食纤维经典测定方法（酶－ 重量法，ＡＯＡＣ ９８５．２９）所检测。聚葡萄糖作为一种多糖，可用苯酚硫酸 法检测，但这种方法在测定未知含量的产品时准确度不 够高；而ＡＯＡＣ ２０００．１１建议的聚葡萄检测方法，是用 带有电化学检测器的阴离子交换色谱进行检测（ＨＰＡＥＣ－ ＥＤ），该法对色谱柱和检测器的要求比较高。本实验研 究了凝胶色谱法测定聚葡萄糖分子量和含量的方法，方 法简单快速，用于样品测定结果满意。
Fig.2
图２ 葡聚糖标准品的色谱图 HPLC chromatograms of Dextran standards
Fig.3
ｌｇＭ
４．６ ４．４ ４．２
４ ３．８ ３．６ ３．４ ３．２
３ ２．８
１４ １５ １６ １７ １８ １９
时间（ｍｉｎ）
图３ 葡聚糖分子量与保留时间的标准曲线 Calibration curve of molecular weight and retention time
424 2007, Vol. 28, No. 08
食品科学
※分析检测
表１ 标准品和样品在流动相中系统适用性试验
Ta bl e 1 ¡¡R esu lt s of HP LC sy st em ap pl ica bi li ty ex ami na ti on in water
葡聚糖标准品 样品１ 样品２ 样品３ 样品４
２．１．２ 流速的选择 调节流动相流速，使其分别为０．３、０．４、０．５、
０．６ｍｌ／ｍｉｎ，保持其它条件不变，进行ＨＰＬＣ 测定。结 果发现：流速对分离效果影响不大；流速大使分离周期 缩短，而流速过大会导致柱压升高，所以流速选择 ０．５ｍｌ／ｍｉｎ。 ２．２ 系统适用性实验［４］
选用蓝色葡聚糖，测试完全被色谱柱填料颗粒排阻 的大分子的保留时间ｔ０，选用葡萄糖，测试能自由进出 色谱柱填料颗粒的小分子的保留时间ｔＴ，样品的保留时 间为ｔＲ，分配系数Ｋｄ＝（ｔＲ －ｔ０）／（ｔＴ －ｔ０），结果见表１。 结果表明，样品在选用的流动相的ＨＰＬＣ 系统中均为选 择性渗透，说明选用Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０色谱柱 系统无误。
ｔＲ（ｍｉｎ） １６．７１ １８．６６ １８．４４ １８．７８ １９．６０
ｔＴ（ｍｉｎ） ２０．２２ ２０．２２ ２０．２２ ２０．２２ ２０．２２
ｔ０（ｍｉｎ） １１．５９ １１．５９ １１．５９ １１．５９ １１．５９
Ｋｄ（ｍｉｎ） ０．５９３ ０．８１９ ０．７９４ ０．８３３ ０．９２８
２．３ 葡聚糖标准品分子量与保留时间的标准曲线 用已知分子量的葡聚糖标准品绘制分子量与保留时
Ｏ
ＯＨ
Ｏ
Ｏ
ＯＨ
ＯＨ
ＯＨ
图１ 聚葡萄糖的结构
Fig.1
Structure of polydextrose
ＣＨ２ＯＨ
Ｏ ＯＨ
Ｏ ＣＨ２
ＯＨ ＯＨ
Ｏ
Ｏ
ＯＨ
ＯＲ
ＯＨ ＯＨ
标准系列葡聚糖：Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ（ＭＷ ２５０００００）、 Ｄｅｘｔｒａｎ １０００（ＭＷ １０００）、Ｄｅｘｔｒａｎ ５０００（ＭＷ ５０００）、Ｄｅｘｔ－ ｒａｎ １２０００ （ＭＷ １２０００）、Ｄｅｘｔｒａｎ ２５０００（ＭＷ ２５０００） Ｓｉｇｍａ 公司；其它试剂均为国产分析纯。
of Dextran standards
２．４ 葡聚糖标准品的标准曲线及回归方程 精取３９．８ｍｇ Ｄｅｘｔｒａｎ ５０００于１０ｍｌ容量瓶中，加水
溶解定容，摇匀得到３．９８ｍｇ／ｍｌ的标准储备液。葡聚糖
标准品经过适当溶解稀释配成系列标准溶液，其范围为０． １９９～３．９８ｍｇ／ｍｌ。进行ＨＰＬＣ分析，进样量为２０μｌ。在 ０．１９９～３．９８ｍｇ／ｍｌ范围内，线性回归方程为：Ａ＝３３８．２１Ｃ －１６．２１７，相关系数ｒ＝０．９９９８，检出限为３．９８μｇ／ｍｌ。 ２．５ 重复性与精密度实验
样品来自河南和山西的生产厂家。 １．２ 色谱条件
液相色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０（７．８×３００ｍｍ， ２５０Ａ） 美国沃特斯公司；保护柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ＤＰ（４．６ ×３０ｍｍ，２５０Ａ） 美国沃特斯公司；流速 ０．５０ｍｌ／ｍｉｎ；流动相 水；柱温４０℃；进样量２０μｌ。 １．３ 方法
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｗａｓ ｒｕｎ ｏｎ ａｎ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０ ｃｏｌｕｍｎ （７．８×３００ ｍｍ） ｗｉｔｈ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ （ＲＩ） ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ ｉｎ ｓｏｍｅ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．５ ｍｌ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．１９９～３．９８ ｍｇ／ｍｌ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｒ＝０．９９９８． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ ｍａｓｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ １０３％ ｔｏ １１０％ ｗｉｔｈ ａ ＲＳＤ ｏｆ １．９１％． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｓｉｍｐｌｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ， ａｎｄ ｔｈｕｓ ｉｄｅａｌｌｙ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ ｉｎ ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ；ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ；ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ 中图分类号：Ｏ６５７．７２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０８－０４２２－０４
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙ ＨＰＬＣ
ＫＡＮＧ Ｑｉ，ＺＨＵ Ｒｕｏ－ｈｕａ＊ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３７， Ｃｈｉｎａ）
※分析检测
食品科学
2007, Vol. 28, No. 08 423
ＣＨ２ＯＨ
Ｏ ＯＨ
ＯＨ ＯＨ
ＣＨ２ＯＨ
Ｏ ＯＨ
Ｏ ＣＨ２
ＯＨ ＯＨ
ＣＨ２ＯＨ
Ｏ ＯＨ
ＯＨ
Ｏ
Ｏ ＣＨ２
ＯＨ
ＯＨ ＯＨ
Ｏ
Ｏ
ＯＨ
Ｏ
ＯＨ ＯＨ
ＣＨ２ＯＨ
Ｏ ＣＨ２
Ｏ ＯＨ
ＯＨ
Ｏ ＣＨ２
Ｏ ＯＨ
ＯＨ
Ｏ ＯＨ
Ｏ ＣＨ２
ＯＨ ＯＨ
Ｏ ＯＨ
ＣＨ２ＯＨ
间的标准曲线，由样品的保留时间计算样品分子量。葡 聚糖标准品的色谱图见图２，分子量与保留时间曲线如 图３所示。葡聚糖标准曲线为ｌｇＭ＝－０．３５２６ｔ＋９．４５８６，ｒ ＝０．９９４７。
４ ４
３
２３ １
２
峰面积
１
０
０ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ 保留时间（ｍｉｎ）
流动相：水；流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；ＲＩ 检测器；葡聚糖浓度： ２ｍｇ／ｍｌ。 色谱峰１～４分别为２５０００、１２０００、５０００、１０００Ｄａ 聚葡萄糖标准。
１ 材料与方法
１．１ 仪器与试剂 高效液相色谱岛津ＬＣ－６Ａ系统；ＲＩＤ－６Ａ（示差检测
器）； Ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＳＣＬ－６Ａ；ＥＣｈｒｏｍ ９８色谱工作 站；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 超纯水过者简介：康 琪（１９８０－），女，硕士研究生，主要从事色谱和食品分析研究。
膳食纤维作为人体“第七营养素”已经成为营养 学家、流行病学家及食品科学家等关注的热点。研究 表明：膳食纤维可以降低某些癌症、心血管和糖尿病［１］ 的发病率；许多常见病，如高血压、冠心病、便秘、 肥胖以及严重威胁人类生命的结肠癌等都与膳食纤维的 摄入量不足有关。另一方面，膳食纤维的过量摄取会 对人体产生某些不利影响，例如：使热量摄取不足［２］； 降低矿物质和痕量元素的生物利用率［３］。世界卫生组织 建议的总膳食纤维摄入量下限为每人每天２７．０ｇ，上限 为每人每天４０．０ｇ。因此正确检测出食品中膳食纤维含 量具有重大意义。
精确称量样品和标准品于容量瓶中，高纯水定容至 刻度，超声溶解，并在混匀器上混匀。过０．４５μｍ 滤 膜，进样，按１．２ 色谱条件进行ＨＰＬＣ 测定。
２ 结果与分析
２．１ 色谱条件选择
２．１．１ 流动相的选择 由于聚葡萄糖属于水溶性物质，在使用Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ
２５０凝胶色谱柱测定水溶性高分子化合物相对分子质量时 常发生吸附。可以添加少量低分子电解质抑制聚电解质 的电离，使流动相离子强度达到一定浓度，以使保留 体积趋于恒定；而且当离子浓度低时，溶质分子之间的 电荷排斥力使分子发生膨胀，从而使溶质较早地从凝胶
中洗出。提高离子强度，不仅抑制分子膨胀，而且减 少样品在柱上的吸附。为此本实验选择了水、０．０１２５、 ０．０２５０、０．０５０、０．１００、０．２００ｍｏｌ／Ｌ ＮａＮＯ３ 作为流动相 淋洗标样Ｄｅｘｔｒａｎ２５０００和样品。Ｄｅｘｔｒａｎ ２５０００和样品在 以上流动相中的色谱峰形状相似，在不同浓度的ＮａＮＯ３ 和水淋洗下的出峰时间及保留时间是基本一致的。可以 认为，改变流动相离子强度，不会明显影响Ｄ ｅ ｘ ｔ － ｒａｎ２５０００ 和样品的色谱行为。为延长色谱柱的使用寿 命，在基本不影响测定效果的情况下，本实验采用水 作为流动相。
２．５．１ 重现性实验 精密称取五份样品按１．３ 实验方法对样品进行测
定。计算相对标准偏差ＲＳＤ，判断方法重现性。五份 样品峰面积平均值为１０２３．４１８，ＲＳＤ为１．１１％。
２．５．２ 精密度实验 分别精取浓度为０．１９９ｍｇ／ｍｌ的葡聚糖标准品溶液和
浓度为２．２０４ｍｇ／ｍｌ的样品重复进样五次，每次２０μｌ，记 录峰面积。实验结果如表２ 所示。
422 2007, Vol. 28, No. 08
食品科学
※分析检测
高效液相色谱法测定聚葡萄糖含量的研究
康 琪，朱若华＊
（首都师范大学化学系， 北京 １０００３７）
摘 要：用Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０（４．６×３００ｍｍ）色谱柱，以水作流动相，示差折光检测，进样量２０μｌ，在流 速０．５ｍｌ／ｍｉｎ下，直接测定样品中的可溶性膳食纤维聚葡萄糖含量和平均分子量。建立了分子量与保留时间的关系 方程，用于样品中聚葡萄糖的分子量测定。聚葡萄糖浓度在０．１９９ｍｇ／ｍｌ～３．９８ｍｇ／ｍｌ范围内与峰面积呈良好的线性 关系，方法ＲＳＤ 小于１．００％，回收率１０３％～１１０％（ＲＳＤ＝１．９１％）之间。结果显示，该方法是简单、准确、可靠 的，适合于食品中水溶性膳食纤维聚葡萄糖含量的测定。 关键词：高效液相色谱；水溶性膳食纤维；聚葡萄糖