自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.

自然界中产淀粉酶菌株分离

纯化及酶活测定

淀粉酶（Amylase）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda[3, 4]，Mizokami[5]，Tamiguchi[6]，Kainuma[7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus. sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。

本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm土层取土壤样品中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定[8]。同时，拟进行发酵条件的优化以提高菌株的酶产量，分离提纯产生的淀粉酶并进行酶活力测定，为利用该菌株进行工业化生产淀粉酶提供初步的理论依据。

1. 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 分离材料

种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm土层取土壤样品。

1.1.2 培养基

(1) PDA固体培养基[9]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。pH 5.5~6.5 之间，121 ℃灭菌20 min。

(2) 平板筛选培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉20g，琼脂15~20g，pH 自然，121 ℃灭菌20 min。

(3) 发酵培养基[10]：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 10g，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

(4) LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，pH 自然，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂配制

DNS试剂[11]：酒石酸钾钠18.2g，溶于50mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，室温保存。

CTAB 法所用主要试剂：提取缓冲液: 2×CTAB提取液（2%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 50 mmol/L EDTA(pH8. 0), 1. 4 mol/L NaCl）；10×CTAB 提取液(10%CTAB, 0.7 mol/L N aCl)；TE 缓冲液: 100 mmol/L T ris-HCl (pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)。

电泳缓冲液：取50×TAE（242 g Tris碱和57.1 mL冰乙酸溶于100 mL 0.5 mol/L 的EDTA(pH8.0)溶液中，加去离子水至1000 mL）20 mL加蒸馏水至1000 mL；溴化乙锭(EB)：称取5 g溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，溶于蒸馏水中并定容到10 mL，避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍，使其最终浓度达到0.5 μg/mL；1.0%的凝胶：称取琼脂粉1.0 g，加热使之溶于100 mL的电泳缓冲液，加入5 μL EB，混匀。

氨苄青霉素（Ampicillin）（100 mg/mL）：溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL。分装成小份于-20℃贮存。以50 μg/mL的浓度添加于生长培养基。

大肠杆菌质粒提取相关试剂：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1%SDS混合液(使用前新配制)；溶液III：5 mmol/L KAc溶液pH 4.8；去离子水：双蒸水灭菌得到；酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）；无水乙醇；75%的乙醇。

克隆相关试剂0.05 mol/L CaCl2溶液；含15%甘油的0.05 mol/L CaCl2溶液；克隆克隆试剂盒(宝生物工程有限公司)：pMD19-T Vector*1(50 ng/μL)，contor insert

(50 ng/μL)，Solution I、X-Gal、IPTG、Amp。

1.1.4 主要化学药品和试剂

本实验中用到的主要化学药品和试剂如表1-1所列。

表1-1 主要化学药品和试剂

名称纯度来源

蛋白胨分析纯杭州微生物试剂有限公司

牛肉膏分析纯杭州微生物试剂厂

硫酸铵分析纯上海化学试剂有限公司

氯化钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司

葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司

酒石酸钾钠分析纯金山区兴塔美兴化工厂3，5-二硝基水杨酸分析纯上海晶天生物科技有限公司苯酚分析纯杭州双林化工试剂厂

氢氧化钠分析纯上海虹光化工厂

盐酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司

PEG 1000 分析纯杭州高晶精细化工有限公司

PEG 6000 分析纯杭州高晶精细化工有限公司

可溶性淀粉分析纯广东.汕头市西陇化工厂

无水乙醇分析纯杭州长征化工厂

氯化钙分析纯上海化学试剂有限公司

Tris碱分析纯杭州南天生化试剂经营部

冰乙酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司

异戊醇分析纯杭州高晶精细化工有限公司

溴化乙锭分析纯杭州高晶精细化工有限公司

醋酸钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司

EDTA 分析纯广东山头市西陇化工厂

SDS 分析纯广东山头市西陇化工厂

结晶紫实验室自配

碘液实验室自配

番红实验室自配

琼脂粉细菌级杭州微生物试剂有限公司

1.1.5 主要仪器设备

本实验中用到的主要仪器和设备如表1-2所列。

表1-2 主要仪器和设备

名称型号制造商或产地

电子天平（BS323S）北京赛多利斯仪器系统有限公司

酸度计（DeLta320）瑞士梅特勒-托利多

加热恒温鼓风干燥箱（DGG-9070B型）上海嘉信实验仪器有限公司

超净工作台（SW-CJ-2G）苏州净化设备厂

电子显微镜（Nikon YS100）尼康映像仪器销售(中国)有限公司

高压灭菌锅（YXQ-280 SD型）嘉兴市中新医疗仪器有限公司

生化培养箱（SPX-250B-Z型）上海博逊实业有限公司医疗设备厂

台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1）太仓市实验设备厂

PCR自动系列化分析仪(Biometra)德国Biometra

海尔冷藏柜（SC-209) 青岛海尔电器集团公司

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉酶产生菌分离方法：涂布接种法[12]。

1.2.2 淀粉酶产生菌纯化方法：平板划线法。

1.2.3 淀粉酶产生菌初步鉴定方法：革兰氏染色。

1.2.4 淀粉酶产生菌产酶条件优化：单因素法[11, 13-14]。

根据几种变量来优化产酶条件：改变基础发酵培养基中氮源，碳源或是NaCl 等的浓度。

1、不同碳源对酶活的影响

以蛋白胨为氮源，改变基础发酵培养基中碳源的种类，配制液体发酵培养基。121 ℃灭菌20 min．以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5％的接种量接种12 h种子，37℃，160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。

2、不同氮源对酶活的影响

以麸皮作为碳源，改变基础发酵培养基中氮源的种类，配制液体发酵培养基。

3、不同NaCl含量对酶活的影响

改变基础发酵培养基中NaCl的浓度，配制液体发酵培养基。

4、初始发酵温度对酶活的影响

基础发酵培养基，121℃灭菌10 min。考虑到菌株的生长温度范围是28℃～50℃，故以28℃，37℃，45℃，作为培养温度，以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5％的接种量接种12 h种子，37℃，160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。

5、培养基初始pH对最终酶活的影响

基础发酵培养基，121℃灭菌10 min。考虑到菌株的生长pH范围是4.7～9，

故在pH 4～10范围内测定酶活。

6、碳氮比对产酶的影响

以麸皮作为碳源，黄豆粉作为氮源配制液体发酵培养基。

1.2.5 粗酶提取物的制备：双水相萃取法[15]。

双水相萃取系统系在室温(22±2)℃下按重量配制。在50 mL烧杯中加入所需重量的硫酸铵和氯化钠，PEG 1000和PEG 6000以50％浓溶液形式加入，预处理发酵液均按系统总重量的50％加入。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH，体系总重量为10g，不足部分以自来水朴充。各组分的浓度均用重量百分含量表示。用玻璃棒搅匀烧杯中混合物，定量转至10 mL刻度离心管中，然后于2000 r/min 离心2 min分层。此时α－淀粉酶和蛋白酶分配到上、下两相，发酵液中不溶物和菌体以固体物形式集中在两相之间。读出上、下两相体积，用注射器分别吸出一定量的上、下两相溶液，测定酶活和总蛋白含量。

1.2.6 酶活力测定：等量对照法[16-17]。

酶活性的测定取洁净的试管若干，作好标记，每一种提取物设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的0.1 mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)。将试管放入恒温40℃的水浴锅中，保温30 min后取出，立即加入1.5 mL的DNS试剂终止反应。再将试管置于沸水浴中10 min，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520 nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。

2. 主要技术路线

主要技术路线如图2-1所示：

图2-1 主要技术路线

3. 预期结果

本实验首先通过涂布接种、平板划线等方法从土壤样品中分离得到土壤微生物，然后经过筛选培养基上培养筛选出淀粉酶产生菌。选取产酶能力强的菌株，采用单因素法对筛选的淀粉酶产生菌进行发酵工艺优化，通过酶活力测定确定该淀粉酶产生菌生产的淀粉酶的活性，分析所得淀粉酶粗提物的质和量确定该菌株产淀粉酶的最优条件。通过对16S rRNA序列分析确定该菌的种属。

4. 参考文献

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酵母蔗糖酶的提取工艺

酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述

第四章酶的提取与分离纯化

第四章酶的提取与分离纯化 1、细胞破碎的目的、方法。 ?大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。 ?机械法 ?物理法 ?化学法 ?酶促破碎法（酶解） 2 选择细胞破碎方法的依据。 ?（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。 ?（2）细胞壁的强度与结构 ?（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。 ?（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。 ?（5）提取分离的难易 3. 酶抽提的目标及方法。提取目标： ? a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 ? b. 保持生物活性。提取原则 ? a. 相似相溶。 ? b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。（2）密度梯度离心特点：： ?区带内的液相介质密度小于样品物质 ?颗粒的密度。 ?适宜分离密度相近而大小不同的固相 ?物质。（3）等密度梯度离心特点： ?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 ?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。 5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。种类： ⑴中性盐沉淀（盐析法）基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 ⑵有机溶剂沉淀利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

离子交换层析分离纯化蔗糖酶

实验报告课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：成绩：__________________ 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶一、实验目的和要求： 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验内容和原理： 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。基质————电荷基团————反离子专业：姓名：学号：日期：地点：装订线溶液中的离子或离子化合物

阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+ 阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》— 由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。三、实验材料与试剂：

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定计划学时：8学时一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。三、实验用品 1．器材（1）小铁铲和无菌纸或袋。

蛋白质和酶的分离与纯化培训讲学

蛋白质和酶的分离与纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术

蔗糖酶的分离提纯讲解

蔗糖酶的分离提纯【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂 (1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液； CH 2OH H OH H H OH CH 20H

(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴； (4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入 1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。 (2)提取及粗酶的制备往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。2．乙醇分级将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32％乙醇饱和度按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。

蔗糖酶的提取分离

蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。 AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 ①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物

分离产淀粉酶的芽孢杆菌要点

微生物学设计性实验报告项目组长＿学号＿＿成员专业＿生物科学班级＿＿实验项目名称＿土壤中微生物的分离及分类＿指导教师及职称＿＿＿开课学期至学年＿＿学期上课时间从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、摘要本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。三、实验仪器设备主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液四、实验方案设计（一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌

溶菌酶的提取分离和纯化实验报告

生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411 学号组别7 姓名

实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。

预习报告（手写，可自行续页）

实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化（1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）

参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析

参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。（本实验以酵母为原料）一、教学目的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。二、教学内容

-淀粉酶的提取要点

α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶 1.1 试剂及设备离子交换树脂 -20℃冰箱样品管（5-10ml试管） 1.5ml离心管紫外分光光度计 α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶 1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。

但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。 20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。随着环境科学的发展，不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。1975年美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出了离子交换分离抑制电导检测分析思维即提出了离子色谱这一概念离子。色谱概念一经提出便立即被商品化产业化由Dow公司组建的Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国从20世纪80年代开始引进离子色谱仪器，在我国八五、九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目，对其进行了重点技术攻关。色谱的分类色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类 1. 按应用领域不同分类制备色谱半制备色谱 2. 以流动相和固定相的状态分类气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳离子交换色谱离子色谱分离主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子。它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速达到交换平衡。离子交换树脂耐酸碱，可在任何pH范围内使用，易再生处理，使用寿命长。缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。离子色谱基本流程图如下图所示：

酵母蔗糖酶的提取及性质测定

酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O

α-淀粉酶分离提纯技术研究进展

α-淀粉酶分离提纯技术研究进展摘要：为了更好地研究α-淀粉酶的性质与应用α-淀粉酶，我们需要不断地从不同的生物体内提取α-淀粉酶并将其高纯化。随着生物技术的不断发展，分离提纯的方法也越来越复杂越精确，然而它却为生物学的发展奠定了一定的基础，此篇综述简要地说明近年来国内外在α-淀粉酶的分离纯化等方面成就，也部分介绍了α-淀粉酶的研究现状和工业应用以及发展前景。关键字：α-淀粉酶分离提纯现状应用前景 α-淀粉酶(α-Amylase)是一种内切葡萄糖苷酶，属于淀粉酶。米黄色、灰褐色粉末。能水解淀粉中的α-1,4,葡萄糖苷键，在催化水解α-1,4-糖苷键只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。作用温度范围60-90℃，最适宜作用温度为60-70℃，作用pH值范围5.5-7.0，最适pH值为6.0。Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。主要存在于人的唾液和胰脏中也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。一、α-淀粉酶分离提纯的研究历史与现状 1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉(Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲 600单位。用硫酸铵分段沉淀，Sephadex G一75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化，经PAGE 鉴定为一条带。以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖分别占6.4％、32.3％、37.1％、10.9％。麦芽糖和麦芽三糖二者之和占69.4％,与Novo公司Norman报道的相似，属糖化型α-淀粉酶，可用于制糖、啤酒和面包食品工业，并可以替代一淀粉酶生产麦芽糖浆。米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低，避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂。 1992年姜涌明等采用壳聚糖絮凝、淀粉吸附、乙醇沉淀等步骤，从枯草芽孢杆菌86315发酵液中提取了α-淀粉酶。然后用Sepbadex G一100凝胶过滤、DEAE—纤维素柱层析进一步提纯，得到DISC-电泳一条带的淀粉酶制剂，从而更好地研究其动力学问题。 1994年西北大学李汉、李华儒等率先开发了一个用强阴离子高效液相色谱分离纯化α-淀粉酶的新方法，在给定的条件下纯化工业α-淀粉酶，其活性回收率达96％，比活性为388u／mg蛋白质．纯化倍数提高30倍，经SDS-PAGE分析，得到分子量分别为58K和33K两条α-淀粉酶谱带。此法纯化α-淀粉酶简单、快速、救率高，不仅能纯化工业粗酶，也可纯化其它来源的α-淀粉酶。在当时，此法的研究成功为大规模制备高纯度α-淀粉酶提供了一个新工艺路线。在1995年时，唐梓进、肖俊方等针对工业α-淀粉酶常混有其他酶类的问题，改良了淀粉微球亲和吸附纯化α-淀粉酶的方法，将淀粉做成网状结构微球，作为亲和吸附载体，装柱后用于吸附、纯化淀粉酶。此球机械强度大，对酶吸附量高达125mg／mL床体积。低温条件下(4℃)操作，球与酶很少反应，重复操作9次未见明显变化。工业生产较纯的酶经一次过柱后，酶比活仍提高2.3倍，每克干粉酶活提高16.5倍。整个操作过程简单、方便，酶失活很少，过柱后回收率高达91.6％。此球既适用于工业生产中纯化淀粉酶，也适用于实验室中淀粉酶的