分子与细胞免疫学

・分子与细胞免疫学・
CD226(PTA1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究①
张 欧阳为明　韩卫宁　杨　琨　李　琦　张继帅　金伯泉②　
(第四军医大学免疫学教研室,西安710032)
中国图书分类号　R392111 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2002)022*******
摘　要　目的:研究C D226分子在NK细胞克隆上的表达及功能。

方法:用有限稀释法建立NK细胞克隆并鉴定。

采用重导向杀伤实验(redirected cytotoxicity assay,RC A)观察C D226单克隆抗体对NK细胞克隆杀伤作用的影响,并用E LIS A方法检测杀伤相培养上清中细胞因子水平的动态变化。

结果:获得1株NK细胞克隆。

在重导向杀伤实验中,C D226单克隆抗体能明显提高NK细胞克隆的杀伤水平;促进NK细胞克隆IFN2γ和G M2CSF的分泌。

结论:C D226是一种新的NK细胞活化性受体,IFN2γ和G M2CSF水平升高可能与NK细胞克隆功能有关。

关键词　C D226　NK细胞　细胞克隆　RC A
CD226(PTA1)monoclonal antibody induced the cytotoxicity of NK cell clone in re2 directed cytotoxicity assay
ZH ANG Yun,OUY ANG Wei2Ming,H AN Wei2Ning et al1Department o f Immunology,Fourth Military Medical Univer si2 ty,Xi’an710032
Abstract　Objective:T o investigate the expression and function of C D226on NK cell clone1Methods:NK cell clone was established by limited dilution,and identified by FC M1The function of C D226on the cytotoxicity of NK cell clone was detected by RC A and the NK cell clone secreted cytokines in the supernatants during the killing phase were measured by E LIS A1R esults:One NK cell clone was obtained by lim2 ited dilution1The cytotoxicity of this clone was upregulated markedly by C D226mAb,and the secretion levels of IFN2γand G M2CSF by NK cell clone increased obviously in RC A1Conclusion:C D226is a novel NK cell activation receptor,and the elevated IFN2γand G M2CSF levels may be related to C D226mAb2enhanced NKfunction1
K ey w ords　C D226　Natural killer cells　Cell clone　RC A
血小板和T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen1,PT A1)是1997年克隆成功的一种新的白细胞分化抗原,在2000年国际白细胞分化抗原会议上被正式命名为C D2261。

C D226主要表达在活化T细胞和血小板表面,参与CT L的分化和血小板的活化聚集2。

进一步研究发现C D226还表达于NK细胞表面。

NK细胞是天然免疫中一类重要的淋巴细胞,具有自然杀伤功能并参与免疫调节。

近来关于NK细胞受体的研究为深入了解NK细胞的功能和作用机制提供了重要的理论基础。

C D226为表达于NK细胞的一种新的膜分子,其功能的阐明为研究NK细
①本课题受国家自然科学基金重点项目(NO130030130)和面上项目
(NO139970688)资助
②通信作者
作者简介:张 ,女,27岁,博士,主要从事免疫膜分子的研究;
指导教师:金伯泉,男,58岁,教授,博士生导师,主要从事细胞与分子免疫学研究。

胞的杀伤功能提供依据。

我们应用重导向杀伤实验(redirected cytotoxicity assay,RC A)观察C D226分子对NK细胞克隆杀伤功能的影响,并检测杀伤相培养上清中几种主要细胞因子水平的变化,初步探讨C D226与C D16分别活化NK细胞克隆的杀伤机制。

1　材料与方法
111　材料　C D226mAb、C D3mAb、C D16mAb以及对照抗体葡萄球菌肠毒素(SE B)由本室制备。

C D56 mAb和羊抗鼠IgG交联免疫磁珠购自C oulter公司。

Daudi细胞、P815细胞和7211221细胞由本室冻存。

rhI L22由第二军医大学曹雪涛教授惠赠。

PH A和RPMI1640粉购自Sigma公司。

新生牛血清购自杭州四季青生物材料公司。

Na
2
CrO4购自Amersham公司。

T NF2αE LIS A检测试剂盒由本室制备,IFN2γ和G M2CSF E LIS A检测试剂盒购自晶美公司。

112　方法
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・
张 等　C D226(PT A1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究　第2期
11211　混合淋巴细胞培养(M LC )　按文献3稍加
改良。

简言之,无菌抽取正常人外周血,采用密度梯
度法分离外周血单个核细胞(P BMC ),按115×10
6
P BMC ∶015×106
3000Rad 照射过的Daudi 细胞Π2ml 完全培养基比例在24孔板中培养,加入rhI L 22至终浓度100U Πml 。

第4天每孔加入1ml 含有rhI L 22的新鲜完全培养基,37℃,5%C O 2培养6d 。

11212　免疫磁珠分离NK 细胞(C D56+
细胞)　收集
培养6d 的M LC 细胞,用C D56mAb 和免疫磁珠进
行分离,操作参照说明书。

将得到的C D56+
的NK 细胞继续培养2d 后,磁珠即从结合的细胞上脱落下来,细胞用于制备NK 细胞克隆。

11213　NK 细胞克隆的建立
4
　用5000Rad 照射
过的1×105P BMC ∶1×104
7211221Π孔作为饲养细胞,将分离得到的NK 细胞按50、25、1215和1个Π孔分别接种于4块96孔板中培养,第1天加入PH A 至终浓度4μg Πml ,rhI L 22至终浓度200U Πml 。

以后每3d 加入I L 22至终浓度100U Πml ,14～21d 长出克隆。

挑选单克隆,扩大培养于24孔板,流式细胞仪鉴定。

11214　间接免疫荧光染色和FC M 分析　调整细胞
浓度为5×106ml -1
,取40μl 细胞悬液加入预先有不同mAb 的管中,再加入50μl 1∶20(用DP BS 稀释)灭活正常兔血清,4℃作用30min 。

用洗涤液洗涤2
次。

弃上清,加入工作浓度的羊抗鼠荧光标记抗体
(1∶200稀释),充分振摇,4℃作用30min 。

用洗涤液洗涤2次。

加适量固定液,FC M 检测。

11215　重导向杀伤实验5
　收集对数生长期P815
细胞,加入51
Cr 至100μCi Π110×106细胞,37℃孵育115h ,中间每隔15min 晃动1次。

标记完毕后洗涤3次,调整靶细胞浓度至110×105
Πml ,加入96孔U
型板,100μl Π孔。

收集NK 克隆细胞与相应的抗体在
37℃孵育30min 后,按5:1,215:1和1:1的效靶比
加入含有100μl Π孔51
Cr 标记P815细胞的96孔U 型
板中。

37℃孵育4h ,收集上清,用γ计数仪检测51
Cr 释放cpm 值,按以下公式计算特异性杀伤率。

同时
做不掺入51
Cr 且效靶比为5:1的平行组,效应细胞和靶细胞分别培养0、4、8和12h ,收集上清,测定上
清中T NF 2α、IFN 2γ和G M 2CSF 的水平。

特异性杀伤率(%)=
实验组cpm -自然释放cpm
最大释放cpm -自然释放cpm
×100%。

11216　E LIS A 试剂盒检测杀伤上清中细胞因子水
平　按照试剂盒说明操作。

2　结果
211　NK 细胞克隆的鉴定　该NK 细胞克隆C D56
表达率为6319%,C D3表达率为318%,C D226表达
率为6112%(图1)。

图1　CD226在NK 细胞克隆上的表达
Fig.1　The expression of CD226on NK cell
clone
图3　CD226单抗诱导NK 细胞克隆杀伤的上清中细胞因子水平的变化Fig.3　The levels of cytokines produced by effector in RCA
・08・中国免疫学杂志2002年第18卷
图2　CD226单抗诱导NK细胞克隆重导向杀伤
Fig.2　CD226mAb enh anced the cytotoxicity of NK cell clone in RCA
212　C D226单抗促进NK细胞克隆重导向杀伤水平　在重导向杀伤系统中,C D226mAb能明显提高NK 细胞克隆的杀伤水平。

当效靶比为5∶1时,加入C D226mAb组杀伤率为4510%,是阴性对照组杀伤水平的6倍;阳性对照组C D16mAb的杀伤率为5617%(图2)。

213　C D226单抗促进NK细胞克隆细胞因子的分泌　在重导向杀伤系统中,C D226mAb活化NK细胞杀伤,同时促进细胞因子的分泌。

杀伤相培养上清中IFN2γ和G M2CSF的水平随培养时间延长而升高,在最初4h内上升最明显。

C D226mAb活化NK细胞克隆杀伤促进G M2CSF水平的升高较阳性对照组C D16mAb引起G M2CSF水平的升高早,而C D16mAb 较C D226mAb活化NK细胞克隆产生T NF2α的含量高(图3)。

3　讨论
NK细胞是天然免疫中一类重要的淋巴细胞。

当其抑制性受体的配体MHC I类分子下调时,由于解除了对抑制性受体的作用从而激活其杀伤活性,因此在大多数情况下,NK细胞杀伤的是下调或丢失MHC I类分子的病毒感染细胞或肿瘤细胞。

另一方面,活化性受体的配体与相应受体作用亦可激活NK 细胞杀伤活性,NK细胞的杀伤水平取决于上述2类受体的平衡6。

在重导向杀伤系统中5,NK细胞原本不杀伤P815细胞。

加入目的分子相应的抗体,该抗体Fc段与P815细胞上高表达的FcR相结合,抗体Fab段与NK细胞上相应的分子结合,如果激活NK细胞的杀伤活性,则目的分子为NK细胞活化性受体;如果对NK细胞杀伤活性没有影响,则目的分子为与NK细胞杀伤功能无关的膜分子(如本实验中C D56分子);如果能降低由活化性受体引起的NK细胞杀伤活性,则目的分子为NK细胞抑制性受体。

应用重导向杀伤系统已鉴定NK细胞上多种活化性受体和抑制性受体。

活化NK细胞可分泌多种细胞因子,主要有IFN2γ、T NF2α、G M2CSF、M2CSF和I L25等。

IFN2γ参与多方面免疫调节功能:(1)可活化巨噬细胞促进其杀伤和吞噬功能;(2)诱导Th0细胞向Th1方向分化;(3)促进B细胞合成Ig过程中的类别转换。

G M2 CSF和M2CSF可能参与调节造血细胞的分化,T NF2α则具有直接杀伤靶细胞和免疫调节的作用,从而赋予NK细胞抗感染(病毒、寄生虫和胞内寄生菌等)、抗肿瘤及免疫调节功能7。

在本实验系统中用NK细胞克隆作为杀伤效应细胞。

NK细胞克隆鉴定中C D226的表达率为6112%。

RC A实验中,C D226mAb刺激NK细胞杀伤率是阴性对照组的6倍,与杀伤上清中IFN2γ和G M2CSF水平的明显升高相一致,说明C D226(PT A1)是NK细胞上一种新的活化性受体。

此外,C D226 mAb与C D16mAb引起细胞因子水平升高的时相并不完全相同;C D16mAb能明显升高杀伤上清中T NF2α的水平,而C D226mAb引起的T NF2α水平的升高却不十分明显,提示二者在活化NK细胞克隆通过分泌细胞因子杀伤靶细胞的机制可能不尽相同。

4　参考文献
1　金伯泉1H LDA7命名的CD分子特征J.细胞与分子免疫学杂志,2000;16(5):373
2　Sherrington P D,Scott J L,Jin B Q et al1T liS A1(PT A1)activation an2 tigen im plicated in T cell differentiation and platelet activation is a mem2 ber of the immunoglobulin superfamily exhibiting distinctive regulation of expressionJ.J Bio Chem,1997;272(35):21735
3　Aramburu J,Balboa M A,Ramirez A et al1A novel functional cell sur2 face dimmer(K p43)expressed by natural killer cells and T cell receptor2 gammaΠdelta+T lym phocytesJ.J Immunol,1990;144:3238
4　Pantaleo G,Z occhi M R,Ferrini S et al1Human cytocytic cell clones lacking surface expression of T cell receptorαΠβorγΠδJ.J Exp M ed, 1991;168:13
5　Le Drean E,Vely F,Olcese L et al1Inhibition of antigen induced2T cell response and antibody2induced NK cell cytotoxicity by NKG2A:ass ocia2 tion of NKG2A with SHP21and SHP22protein tyrosine phosphatasesJ.
Eur J Immunol,1998;28:264
6　Lanier L L1NK cell receptorsJ.Annu Rev Immunol,1998;16:359
7　金伯泉1自然杀伤细胞M.见:金伯泉主编1细胞与分子免疫学.第2版1北京:科学出版社,2001:444
[收稿2001205218　修回2001208221
(编辑　许四平)
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张 等　C D226(PT A1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究　第2期。