分子与细胞免疫学

・分子与细胞免疫学・

CD226(PTA1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究①

张 欧阳为明　韩卫宁　杨　琨　李　琦　张继帅　金伯泉②　

(第四军医大学免疫学教研室,西安710032)

中国图书分类号　R392111 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2002)022*******

摘　要　目的:研究C D226分子在NK细胞克隆上的表达及功能。方法:用有限稀释法建立NK细胞克隆并鉴定。采用重导向杀伤实验(redirected cytotoxicity assay,RC A)观察C D226单克隆抗体对NK细胞克隆杀伤作用的影响,并用E LIS A方法检测杀伤相培养上清中细胞因子水平的动态变化。结果:获得1株NK细胞克隆。在重导向杀伤实验中,C D226单克隆抗体能明显提高NK细胞克隆的杀伤水平;促进NK细胞克隆IFN2γ和G M2CSF的分泌。结论:C D226是一种新的NK细胞活化性受体,IFN2γ和G M2CSF水平升高可能与NK细胞克隆功能有关。

关键词　C D226　NK细胞　细胞克隆　RC A

CD226(PTA1)monoclonal antibody induced the cytotoxicity of NK cell clone in re2 directed cytotoxicity assay

ZH ANG Yun,OUY ANG Wei2Ming,H AN Wei2Ning et al1Department o f Immunology,Fourth Military Medical Univer si2 ty,Xi’an710032

Abstract　Objective:T o investigate the expression and function of C D226on NK cell clone1Methods:NK cell clone was established by limited dilution,and identified by FC M1The function of C D226on the cytotoxicity of NK cell clone was detected by RC A and the NK cell clone secreted cytokines in the supernatants during the killing phase were measured by E LIS A1R esults:One NK cell clone was obtained by lim2 ited dilution1The cytotoxicity of this clone was upregulated markedly by C D226mAb,and the secretion levels of IFN2γand G M2CSF by NK cell clone increased obviously in RC A1Conclusion:C D226is a novel NK cell activation receptor,and the elevated IFN2γand G M2CSF levels may be related to C D226mAb2enhanced NKfunction1

K ey w ords　C D226　Natural killer cells　Cell clone　RC A

血小板和T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen1,PT A1)是1997年克隆成功的一种新的白细胞分化抗原,在2000年国际白细胞分化抗原会议上被正式命名为C D2261。C D226主要表达在活化T细胞和血小板表面,参与CT L的分化和血小板的活化聚集2。进一步研究发现C D226还表达于NK细胞表面。

NK细胞是天然免疫中一类重要的淋巴细胞,具有自然杀伤功能并参与免疫调节。近来关于NK细胞受体的研究为深入了解NK细胞的功能和作用机制提供了重要的理论基础。C D226为表达于NK细胞的一种新的膜分子,其功能的阐明为研究NK细

①本课题受国家自然科学基金重点项目(NO130030130)和面上项目

(NO139970688)资助

②通信作者

作者简介:张 ,女,27岁,博士,主要从事免疫膜分子的研究;

指导教师:金伯泉,男,58岁,教授,博士生导师,主要从事细胞与分子免疫学研究。胞的杀伤功能提供依据。我们应用重导向杀伤实验(redirected cytotoxicity assay,RC A)观察C D226分子对NK细胞克隆杀伤功能的影响,并检测杀伤相培养上清中几种主要细胞因子水平的变化,初步探讨C D226与C D16分别活化NK细胞克隆的杀伤机制。

1　材料与方法

111　材料　C D226mAb、C D3mAb、C D16mAb以及对照抗体葡萄球菌肠毒素(SE B)由本室制备。C D56 mAb和羊抗鼠IgG交联免疫磁珠购自C oulter公司。Daudi细胞、P815细胞和7211221细胞由本室冻存。rhI L22由第二军医大学曹雪涛教授惠赠。PH A和RPMI1640粉购自Sigma公司。新生牛血清购自杭州四季青生物材料公司。Na

2

CrO4购自Amersham公司。T NF2αE LIS A检测试剂盒由本室制备,IFN2γ和G M2CSF E LIS A检测试剂盒购自晶美公司。

112　方法

・

9

7

・

张 等　C D226(PT A1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究　第2期

11211　混合淋巴细胞培养(M LC )　按文献3稍加

改良。简言之,无菌抽取正常人外周血,采用密度梯

度法分离外周血单个核细胞(P BMC ),按115×10

6

P BMC ∶015×106

3000Rad 照射过的Daudi 细胞Π2ml 完全培养基比例在24孔板中培养,加入rhI L 22至终浓度100U Πml 。第4天每孔加入1ml 含有rhI L 22的新鲜完全培养基,37℃,5%C O 2培养6d 。

11212　免疫磁珠分离NK 细胞(C D56+

细胞)　收集

培养6d 的M LC 细胞,用C D56mAb 和免疫磁珠进

行分离,操作参照说明书。将得到的C D56+

的NK 细胞继续培养2d 后,磁珠即从结合的细胞上脱落下来,细胞用于制备NK 细胞克隆。11213　NK 细胞克隆的建立

4

　用5000Rad 照射

过的1×105P BMC ∶1×104

7211221Π孔作为饲养细胞,将分离得到的NK 细胞按50、25、1215和1个Π孔分别接种于4块96孔板中培养,第1天加入PH A 至终浓度4μg Πml ,rhI L 22至终浓度200U Πml 。以后每3d 加入I L 22至终浓度100U Πml ,14～21d 长出克隆。

挑选单克隆,扩大培养于24孔板,流式细胞仪鉴定。11214　间接免疫荧光染色和FC M 分析　调整细胞

浓度为5×106ml -1

,取40μl 细胞悬液加入预先有不同mAb 的管中,再加入50μl 1∶20(用DP BS 稀释)灭活正常兔血清,4℃作用30min 。用洗涤液洗涤2

次。弃上清,加入工作浓度的羊抗鼠荧光标记抗体

(1∶200稀释),充分振摇,4℃作用30min 。用洗涤液洗涤2次。加适量固定液,FC M 检测。

11215　重导向杀伤实验5

　收集对数生长期P815

细胞,加入51

Cr 至100μCi Π110×106细胞,37℃孵育115h ,中间每隔15min 晃动1次。标记完毕后洗涤3次,调整靶细胞浓度至110×105

Πml ,加入96孔U

型板,100μl Π孔。收集NK 克隆细胞与相应的抗体在

37℃孵育30min 后,按5:1,215:1和1:1的效靶比

加入含有100μl Π孔51

Cr 标记P815细胞的96孔U 型

板中。37℃孵育4h ,收集上清,用γ计数仪检测51

Cr 释放cpm 值,按以下公式计算特异性杀伤率。同时

做不掺入51

Cr 且效靶比为5:1的平行组,效应细胞和靶细胞分别培养0、4、8和12h ,收集上清,测定上

清中T NF 2α、IFN 2γ和G M 2CSF 的水平。

特异性杀伤率(%)=

实验组cpm -自然释放cpm

最大释放cpm -自然释放cpm

×100%。

11216　E LIS A 试剂盒检测杀伤上清中细胞因子水

平　按照试剂盒说明操作。

2　结果

211　NK 细胞克隆的鉴定　该NK 细胞克隆C D56

表达率为6319%,C D3表达率为318%,C D226表达

率为6112%(图1)

。

图1　CD226在NK 细胞克隆上的表达

Fig.1　The expression of CD226on NK cell

clone

图3　CD226单抗诱导NK 细胞克隆杀伤的上清中细胞因子水平的变化Fig.3　The levels of cytokines produced by effector in RCA

・08・中国免疫学杂志2002年第18卷