解磷菌的分离纯化 综述

解磷菌的分离纯化与鉴定
谢冬东
（大理学院农学与生物科学学院 2010级生物科学班，云南大理 671003）
摘要：解磷菌在土壤中的解磷作用越来越受到农业生产中占据重要地位，本文将对解磷菌
的研究现状、解磷机理、研究方法做一个简述，以及采用平板涂布法分析解磷菌对难溶性磷的分解能力进行测定和对菌种进行鉴定的认识。

关键词：解磷菌；解磷作用；解磷机理；分离纯化；鉴定
磷是植物生长发育不可缺少的大量营养元素之一,是植物的重要组成成分,同时又以多种方式参与植物体内各种生理生化过程,对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要的作用（1）。

土壤含有丰富的磷素,既有无机态磷,也有有机态磷,一般是以无机态磷为主（2）。

土壤磷素循环是以微生物活动为中心的。

微生物的活动对土壤磷的转化和有效性影响很大。

国内外大量的研究证明土壤中存在许多微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）。

大量研究表明,某些微生物具有很强的解磷功能,通过其分泌物或吸收作用把土壤中无效态磷转化成有效态磷，采用微生物的解磷作用能够将难溶性的磷酸盐转化为水溶性磷,有效地增加土壤活性磷的含量,从而供植物吸收利用。

因此,对解磷微生物的分离纯化,在生产含有解磷功能的微生物有机肥料对解决植物磷素供应问题是一条很好的途径（3) 。

1 解磷菌的研究现状
不同的微生物解磷能力有较大的差异。

尹瑞龄从土壤中分离出了265 株细菌并测定其分解摩洛哥磷矿粉的能力,发现经过6d的培养,溶磷能力平均为2～30 mg/g ,其中株巨大芽孢杆菌、节杆菌、黄杆菌、欧文氏菌及假单胞菌的解磷能力
较强为25～30 mg/ g。

Sundara利用Ca
3(PO4)
2
作为磷源,经过14 d 的摇瓶培养,
发现几株芽孢杆菌释放的可溶性磷为70. 52～56. 80μg/mL ,埃希氏菌属释放的可溶性磷为159. 70～170. 30μg/mL 。

sundana Rao[测定从豆科植物根际分离
出来的几株芽孢杆菌属溶解Ca
3 (PO4)
2
的效率高达19 % ,其中解磷能力最强的是
巨大芽孢杆菌(B .megaterium) ,最弱的为短芽孢杆菌( B . brevis) 。

Molla and
Chowdhury的研究也表明不同菌株分解Ca
3(PO4)
2
的能力有很大的差异。

林启美等
（4）发现以磷矿粉为惟一的磷源培养解磷菌,解磷能力较强的菌株为假单胞菌属和欧文氏菌属,并发现真菌的解磷能力比细菌强。

溶磷真菌在数量和种类上都少于溶磷细菌,但溶磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌。

目前研究报道的溶磷真菌多为曲霉属和青霉属。

其中黑曲霉是一种溶磷效果非常好的菌株。

Cerezine 和Nahas等报道了液体培养过程中,随着黑曲霉菌丝体的生长,对不溶性磷酸盐的溶解能力增加。

Vassilev等也研究了黑曲霉对矿物磷酸盐的溶解,其溶解能力最高达292 pg PmL/ L 。

Illmer等也报道了黑曲霉等4 种真菌都能有效地溶解难溶性磷酸铝（3）。

汤树德等(5)对霉菌AN2-7的解磷能力进行了研究,其与国内同类型菌株比较,具有产酸率和溶磷效率高的优良特性。

范丙全等(6）筛选得到2株具有溶磷作用的
草酸青霉菌菌株P8 和Pn1。

不同培养条件下测定了它们的溶磷能力,并与拜莱青霉菌ATCC20851和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14581进行了比较。

在固体培养基上草酸
青霉菌P8 、Pn1 表现较强的溶解Ca
3(PO4)
2
、Ca
8
[H
2
(PO4)]
6
·5H
2
O、CaHPO
4
、
FePO
4
和骨粉的能力。

范丙全等（7）在盆栽条件下,研究了溶磷青霉菌P8 对吸收土壤磷素和作物生长的影响。

结果表明,接种青霉菌P8菌剂的土壤都能提高作物的吸磷量,其生物产量比不接种显著提高,且在有效磷低的土壤上其增产幅度大于有效磷高的土壤;刘长霞等（8）从海滨盐碱土筛选出4 种耐盐无机解磷真菌( FM) ,在不同NaCl浓度发酵培养中表现出较强的解磷能力。

王富民等（9）从土壤中筛选出高效溶磷真菌AP2-2 ,能使土壤速效磷含量增加141. 94 %。

以上的研究表明真菌的解磷能力强于细菌。

2 解磷菌的作用及机理
2.1 无机磷酸盐的溶解作用
(1) 微生物在代谢过程中分泌有机酸, 如乳酸、羟基乙酸、草酸和柠檬酸等。

其中草酸和柠檬酸的活化能力很强。

其活化机理是通过制质子酸化、络合溶解等作用促进磷的释放。

(2) 微生物通过呼吸过程放出的CO
2
可降低周围的pH值, 从而引起磷酸盐的溶解。

(3) 某些细菌能释放H
2
S, 它可与磷酸铁作用产生磷酸亚铁和可溶性正磷酸盐离子。

(4) 微生物降解植物残体产生“胡敏酸”和“富里酸”, 它们能与复合磷酸盐中的钙、铁或铝螯合, 释放正磷酸盐。

它们也能与铁或铝的磷酸盐形成稳定的可溶性复合物, 这些复合物可以被植物利用。

2.2 有机磷酸盐的矿化作用
微生物对有机物的矿化作用主要是微生物在代谢过程中产生各种酶类, 如核酸酶、植酸酶等使有机磷酸盐矿化, 成为植物可以吸收利用的可溶性磷。

2.3 固定作用
可溶性磷酸盐进入生长着的微生物细胞内称为固定作用。

当细胞死亡时, 这种暂时被固定的磷酸盐又被释放出来, 可为植物吸收利用。

细菌和放线菌积累的磷(占其干重的1. 5%～2. 5% ) 略高于真菌(0. 5%～ 1% )(10)。

3 土壤中解磷菌的种类
土壤是微生物生长的良好场所。

土壤中能解磷的微生物种类比较多,包括细菌、真菌和放线菌等。

目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属( Bacill us) 、欧文氏菌属( Erwinia) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 、土壤杆菌属( A grobacterium) 、沙雷氏菌属( Serratia) 、黄杆菌属( Flavobacteri2um) 、肠细菌属( Enterbacter ) 、微球菌属( Micro2coccus ) 、固氮菌属( A zotobacter ) 、根瘤菌属( B rady rhizobium) 、沙门氏菌属( S almonella) 、色杆菌属( Cl romobacterium ) 、产碱菌属( A lcali2genes) 、节细菌属( A rthrobacter ) 、硫杆菌属( Thiobacill us) 、埃希氏菌属( Escherichia) ;真菌有曲霉属( Aspergill us) 、根霉属( Rhizopus) 、镰刀菌属( Fusarium) 、小菌核菌属( Sclerotium) ;放线菌有链霉菌属( S t reptomyces)(11)。

而解磷菌在土壤中的数量及种类变化，受土壤质地、有机质含量、土壤类型、耕作栽培方式、气候条件等的影响。

3 解磷菌的分离与纯化
微生物的解磷能力一般有三种测定方法,一是将解磷菌株在含有难溶性磷酸盐的固体培养基上培养, 测定菌落周围产生的透明圈的大小; 二是进行液体培养, 测定培养液中可溶性磷的含量; 三是进行土壤培养, 测定其有效磷的含量。

这里主要采用第一种。

3.1 材料与方法
3.1材料
3.1.1土样
土样采自大理洱海周边耕地里（以农田为主），采样时除去表层5 cm 表土,取5～15 cm 深土壤,5 点采集,每份样品重约500 g。

标记备用。

3．1.2菌肥
肥田生微生物肥料(多种有益微生物固氮菌，根瘤菌，解磷菌，解甲菌复合)，高效冲施宝(含高效活性菌群90株)，垦易活性微生物有机肥，天源生化有机液肥。

3．1．3 培养基
①细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)：牛肉膏3．00 g，蛋白胨10．00 g，食盐5．00 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20．00 g；②基本培养基：葡萄糖l0．00 g，酵母膏0．59 g，硫酸镁0．25 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20．00 g。

3．1．4 试剂和器皿
0.80％生理盐水，10％氯化钙溶液，10％磷酸二氢钾，0．1 moL／L氢氧化钾溶液，新鲜鸡蛋，消毒棉球，无菌水灭菌吸管，无菌空试管，无菌平板，1O ml注射器，涂布棒，pH试纸，25～28 培养箱，结晶紫染色液，碘液，95％乙醇，番红染色液。

3．2 分离方法
配制成培养基后分装于4个三角瓶中，每瓶100 ml，120℃灭菌30 min。

各取菌肥适量，研钵研细，称取1．0 g加入99 rnl盛无菌水的锥形瓶中，振荡15 min，制成1O-2 浓度溶液，然后按1O倍稀释法进行处理，同样制得10-3、10-4、10-5。

浓度菌悬液。

取10-3、10-4、1O-5浓度菌悬液各0．1 ml均匀涂布于相应冷却好的平板上，每个浓度重复3次。

倒置平板，25～28℃培养箱中培养36—48 h。

3．3 纯化方法
在分离平板上选择分离效果较好，已纯化的菌落进行划曲线接种，贴好标签。

已接种好的试管置于30℃培养箱中培养3～5 d，观察是否为纯种，记录特征，置于-4℃冰箱中保藏，有待进一步验证。

3．4 无机磷细菌及有机磷细菌菌株的平板筛选制备磷酸钙盐培养基300 ml，倒平板。

采用三点接种法接到平板上，28℃培养箱中培养5～7 d，根据平板上菌落周围溶磷圈的大小，筛选出解磷能力较强的菌株，保藏相应的菌株。

3．5 磷细菌菌落特征的观察制备牛肉膏蛋白胨培养基100 ml，倒平板后划线，分离出单菌落。

28℃培养，分别于24、48、72 h观察单菌落特征，注意其形状、大小、颜色、光泽、
透明度、表面状况、边缘特征、隆起程度、色素等，并作记录。

3．6 革兰氏染色①涂片一自然干燥一固定一染色；②镜检在油镜下观察，菌体呈蓝紫色的为G+，呈红色的为G-，进行结果统计分析（1,12）。

3.7生理生化鉴定
3.7.1 糖发酵与氧化实验
葡萄糖发酵实验：未隔绝空气的试管中看是否有气泡产生，观察培养基颜色变化。

隔绝空气再观察。

乳糖发酵实验：隔绝空气和未隔气的培养基看是否产酸产气。

3.7.2过氧化氢酶实验
将一滴3%的过氧化氢溶液滴于涂在干净载玻片上的菌苔上，观察是否有气泡产生，有气泡产生，则为过氧化氢酶阳性。

4 菌株的鉴定
按《伯杰氏分类鉴定手册第九版》鉴定
5 小结
本文主要对解磷菌的种类了解、解磷机理和试验方法进行综述，并采用了平板涂布法对分解难溶性磷的菌类进行活力测定和鉴定，其结果对以后的解磷菌的研究和合理施肥提供一定的参考。

但很多方面还是会影响到结果的可靠性：（1）采样时间的不同，一年内四季的天气、温度的变化都会对土壤中微生物的种类数量等产生很大的影响。

（2）采集时的土壤条件，是否近水或者当天的土壤的湿度等也会对微生物的数量和活性产生很大影响。

（3）微生物之间有可能存在很大的共生关系，而把他分离培养就忽略其他微生物的作用。

这些问题都应该在实验研究中引起重视。

6 展望
目前国内外的研究主要是集中在解磷细菌的解磷能力、测定方法上，而对解磷的机制、与其他微生物的关系、如何提高解磷能力方面还没有太多的重视。

未来对解磷细菌的研究应集中在：（1）研究解磷微生物与其他功能微生物的关系,如自生固氮菌、根瘤菌、硅酸盐细菌等的相互作用,特别要注意解磷微生物与病原菌发生发展的关系,及探讨解磷微生物代谢产物与植物生长的关系。

（2）如何规范对解磷微生物肥料的生产和使用。

（3）深入分子水平，构建高效解磷菌株，使农业向着高产、绿色、低污染的方向发展。

参考文献：
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