解磷菌的分离纯化 综述
新疆土壤中解磷菌的分离纯化与鉴定
新疆土壤中解磷菌的分离纯化与鉴定刘思岑;亢秀萍;赵宇;耿雪青;张雄;王磊【摘要】从新疆昌吉市室外土壤中分离纯化出多种细菌,筛选出30株具有解磷效果的菌株.经PVK培养基平板初筛后发现,其中6株菌在平板上的透明溶磷圈较大,分别为A12,A14,A16,B1,B5,C5;经摇瓶复筛后发现,菌株B5的解磷效果最好,溶磷量为519.66 mg/L;16S rDNA序列测定鉴定B5为假单胞菌,并进一步经过生理生化测试,发现当初始pH值为7、盐浓度为0.5％、温度为27 ℃时,该菌株的溶磷量最高.试验结果表明,该菌株在以磷酸钙为磷源时解磷效果最好,溶磷量为523.45 mg/L;磷源为磷酸铁时溶磷效果较差,溶磷量为6.38 mg/L;该菌株对有机磷的溶磷量为24.85 mg/L,解磷菌株的溶磷效果较好.研究结果可为今后研究运用溶磷微生物来提高磷肥的利用率、进一步改善土壤环境奠定基础.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2019(047)005【总页数】5页(P849-853)【关键词】解磷菌;有效磷;pH;植物生长;土壤【作者】刘思岑;亢秀萍;赵宇;耿雪青;张雄;王磊【作者单位】山西农业大学园艺学院,山西太谷030801;山西省设施园艺工程技术中心,山西太谷030801;山西省设施蔬菜提质增效协同创新中心,山西太谷030801;山西农业大学园艺学院,山西太谷030801;山西省设施园艺工程技术中心,山西太谷030801;山西省设施蔬菜提质增效协同创新中心,山西太谷030801;山西农业大学园艺学院,山西太谷030801;山西省设施园艺工程技术中心,山西太谷030801;山西省设施蔬菜提质增效协同创新中心,山西太谷030801;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S154.38+1磷元素是植物所需的三大营养元素之一，磷元素参与植物许多代谢过程，包括细胞分裂、糖类物质代谢、脂类代谢、光合作用以及呼吸作用等过程，磷元素对维持植物的生长发育是必不可缺的。
磷矿区高效解磷菌的分离鉴定及其碱性磷酸酶的克隆表达
磷矿区高效解磷菌的分离鉴定及其碱性磷酸酶的克隆表达宁清; 刘迪; 靳翔; 弓亚杰; 薛智权; 吕建华【期刊名称】《《山西农业科学》》【年(卷),期】2019(047)011【总页数】6页(P1974-1979)【关键词】解磷菌; NBRIP平板筛选; 钼锑抗法; 碱性磷酸酶; 16S rDNA【作者】宁清; 刘迪; 靳翔; 弓亚杰; 薛智权; 吕建华【作者单位】山西农业大学生命科学学院山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q93山西省是矿产资源大省，为国家经济发展作出了不可估量的贡献，但矿产资源开发的同时也使农业生态环境遭受到了非常严重的破坏。
山西省还是全国中药材的主采区之一，是中药资源大省。
而在采矿复垦区种植中药材既能改善复垦区土壤生态系统，也可为当地经济发展带来推动力。
农业生产的重要物质保障离不开磷，它是植物生长发育中最主要的营养元素之一[1]。
然而，矿区复垦土壤因为严重缺乏可溶性磷，造成养分含量降低、微生物数量减少、溶磷活力低下、土壤贫瘠[2-3]，导致作物生长缓慢，产量低，质量差。
为了满足作物对土壤磷元素的需求，提高作物产量，农民大量施用化学磷肥，但施入磷肥的成本高、有效转化效率过低、浪费严重；同时化学肥料的过度施用会对土壤和水体环境造成严重的污染[4]，而且肥料中70% 以上的水溶性磷会与土壤中的Fe3+、Al3+、Ca2+ 等结合，生成非常难溶的磷酸盐沉淀。
生物固定化和其他反应会很快耗尽可用的磷酸供应，留下极少部分供给植物[5-6]。
因此，释放土壤中固定化的磷可以增加土壤中磷元素的生物利用度。
土壤微生物在磷循环中起着至关重要的作用，其中，一些细菌可以通过溶解不溶性磷酸盐来提高植物的有效磷库，其被称之为解磷菌。
目前报道，较多的解磷菌主要包括芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、伯克氏菌属（Burkholderia）、无色杆菌属（Achromobacter）、固氮菌（Azotobacter）、农杆菌（Agrobacterium）、微球菌（Micrococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium sp.）等[7-8]。
解磷细菌的筛选与分离
土壤中解磷细菌的分离与纯化摘要：磷细菌是存在于自然界，主要是土壤中的一类溶解(dissolve)磷酸化合物(phosphate compound)能力较强的细菌的总称。
通过磷细菌的作用，可使土壤中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物。
故又称溶磷细菌。
主要有两类，一类称为有机磷细菌，主要作用是分解有机磷化物如核酸、磷脂等；另一类称为无机磷细菌，主要作用是分解无机磷化物，如磷酸钙、磷灰石等。
磷细菌主要是通过产生各种酶类或酸类而发挥作用的。
可用它制成细菌肥料，实践证明，对小麦、甘薯、大豆、水稻等多种农作物，以及苹果、桃等果树具有一定增产效果。
农业上常用的菌有解磷巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium var．phosphaticum），俗称为“大芽孢”磷细菌，此外，还有其他芽孢杆菌和无色杆菌（Achromobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）等。
我们此次试验目的是从土壤中分离出无机解磷细菌，观察解磷细菌的细胞形态，并进行生理生化鉴定，进一步熟悉掌握微生物实验的基本技能。
关键词：土壤解磷细菌无机磷细菌含磷培养基分离提纯生理生化反应实验目的1）掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
2）学习并掌握分离纯化无机解磷细菌的基本方法。
3）巩固和贯通所学的无菌技术、纯培养技术、保藏技术、显微技术、……等微生物操作技术。
4）学习通过微生物的形态特征、生理生化反应来鉴别解磷细菌与其他微生物的异同。
试验原理1）菌种来源：由于各种微生物对营养物质需求不同，在不同地方采样对选取所要的微生物含量和其它杂菌含量的多少直接有关。
所以要选择无机磷含量较高的土壤中采样。
2）培养基的选取：为了使所要的无机解磷细菌能生长，其它微生物生长受到一定的抑制，要用选择培养基。
还要把解磷菌与其他微生物相区别，还要用鉴别培养基。
为了达到即是选择培养基又是鉴别培养基，选取以磷酸钙为唯一磷源的培养基。
土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定
JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本科毕业论文（设计）题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定学院：生物科学与工程学院姓名：学号：专业：生物工程年级：指导教师：职称：二0一一年五月摘要目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。
方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。
从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。
结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。
结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。
关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定AbstractObjective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is,water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria.Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal目录绪论 (1)1 材料与方法 (1)1.1 供试材料 (1)1.1.1 菌株 (1)1.1.2 培养基 (1)1.1.3 主要仪器设备及药品试剂 (2)1.2方法 (2)1.2.1 解磷细菌的生物富集 (2)1.2.2 菌株初筛 (2)1.2.3 解磷细菌的鉴定形态学鉴定 (2)1. 2. 4 解磷细菌解磷能力的测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 结果与讨论 (3)2.1 菌株初筛结果 (3)2.2 解磷菌形态鉴定结果............................... 错误!未定义书签。
土壤解磷细菌分离和筛选方法的建立
土壤解磷细菌分离和筛选方法的建立余贤美;沈奇宾;李炳龙;郑服丛【摘要】以有机磷细菌培养基和无机磷细菌培养基为基本培养基,利用液体培养基进行生物富集,然后通过平板稀释法进行分离筛选,共获得107个菌株.结果表明,以有机磷细菌液体培养基为富集培养基,以无机磷细菌固体培养基为筛选培养基,可以有效地从土壤中分离筛选到解磷菌,初步建立起快速有效筛选解磷菌的体系;固体及液体培养条件下解磷能力的测定结果表明,筛选出的解磷菌有较强的解磷能力,进一步验证了此体系的可行性.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2008(029)003【总页数】5页(P321-325)【关键词】解磷菌;生物富集;筛选;建立【作者】余贤美;沈奇宾;李炳龙;郑服丛【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,热带农业有害生物检测监控中心,海南,儋州,571737;海南大学环境与植物保护学院,海南,儋州,571737;海南大学环境与植物保护学院,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,热带农业有害生物检测监控中心,海南,儋州,571737;海南大学环境与植物保护学院,海南,儋州,571737【正文语种】中文【中图分类】农业科学第 29 卷第 3 期 2008 年 6 月热带作物学报CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS 土壤解磷细菌分离和筛选方法的建立余贤美 l沈奇宾 2李炳龙 2郑服丛1.2•中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南倍州 571737热带农业有害生物检测监控中心2海南大学环境与植物保护学院海南借外I 571737 Vol.29No.3Jun.2008 摘要以有机磷细菌培养基和无机磷细菌培养基为基本培养基，利用液体培养基进行生物富集，然后通过平板稀释法进行分离筛选，共获得 107 个菌株。
结果表明，以有机磷细菌液体培养基为富集培养基，以无机磷细菌固体培养基为筛选培养基，可以有效地从土壤中分离筛选到解磷菌，初步建立起快速有效筛选解磷菌的体系：固体及液体培养条件下解磷能力的测定结果表明，筛选出的解磷菌有较强的解磷能力，进一步验证了此体系的可行性。
花生根际解磷真菌的分离及其解磷能力研究
花生根际解磷真菌的分离及其解磷能力研究摘要[目的]分离花生根际解磷真菌及测定其解磷能力。
[方法]利用土壤稀释平板法，从花生根际土壤中分离筛选出解磷真菌PFK-2，接种于以Ca3（PO4）2为唯一磷源的液体培养基，振荡培养24、48、72、96、120、144、168 h时测定培养液的pH值、速效磷含量、菌丝混合物重。
[结果]随着培养时间的增加，培养液pH值先降低后升高，菌株的溶磷量先增加后降低，菌丝混合物重量增加，当培养时间为120 h时，培养液pH值最低，速效磷含量最大。
培养液pH值与菌丝重、菌株的溶磷量均呈极显著负相关（P<0.01）。
[结论]在振荡培养120 h时，溶磷真菌PFK-2的解磷效果最佳。
Abstract [Objective]Fungi，capable of dissolving phosphorus was isolated from peanut rhizosphere soil.[Method] The Fungi PFK-2 was screened from peanut rhizosphere soil，and Ca3（PO4）2 as the only P source of liquid culture medium were adopted to inoculate Fungi PFK-2，the pH value，available phosphorus content，weight of mycelium of culture medium and the P content absorbed by fungi were measured in shaking culture for 24，48，72，96，120，144 and 168 h.[Result]With the extending of culture time and the pH of culture medium was dropped firstly and then increased，the P solubilization capacity of strains raised firstly and then decrease，weight of mycelium increased，when the culture time was120 h，the pH of culture medium was the lowest，weight of mycelium the highest and the content of available phosphorus the largest.The pH of culture medium all had extremely significant negative correlation with the weight of mycelium and P solubilization capacity of strains （P<0.01）.The P-dissolving ability of inorganic P by Fungi PFK-2 was better than the one of organic P.[Conclusion]The phosphate-dissolving effect of Fungi PFK-2 was the best when shaking culture was for 120 h.Key words phosphate-solubilizing fungi；available phosphorus content；peanut rhizosphere soil磷肥作为植物所需的大量营养元素之一，施用磷肥可以增加土壤中有效磷的含量，但磷与土壤中有机质、Ca2+、Fe3+、Al3+结合会形成难溶性的无机态或有机态磷，从而丧失有效性[1]。
解磷细菌的分离筛选及培养条件优化
解磷细菌的分离筛选及培养条件优化作者：郑喜清邸娜张志超纪晓贝来源：《天津农业科学》2020年第03期摘; ; 要：通过透明圈法与钼锑抗比色法，从巴彦淖尔市临河区旧气象局试验田植物根际土中分离筛选出3株解磷效果好的菌株，通过单因素试验对菌株培养条件进行了优化。
结果表明：不同碳源、氮源、温度、pH值、盐浓度等对其解磷效果存在显著差异。
PB1以木糖做碳源、硝酸铵为氮源、NaCl浓度为0.3 g·L-1、pH值为6、温度30～34 ℃、加液量为100 mL时解磷效果最显著;PB2以果糖做碳源、硝酸铵为氮源、盐浓度为0.7 g·L-1、pH值为6、温度30～34 ℃、加液量为50 mL时最显著。
PB3以葡萄糖或果糖做碳源、硝酸钠为氮源、盐浓度为0.5 g·L-1、pH值为6、温度32 ℃、加液量为100 mL时解磷效果最显著。
根据形态特征及生理生化特性，结合《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》将3种菌株初步鉴定为：PB1为沙门氏菌、PB2为金杆菌属、PB3为芽孢杆菌属。
关键词：解磷菌;条件优化;解磷能力中图分类号：S144.9; ; ; ; ;文献标识码：A; ; ; ; ; ; DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.004Isolation and Screening of Phosphate-solubilizing Strains and Optimization of Culture ConditionsZHENG Xiqing， DI Na，ZHANG Zhichao， JI Xiaobei（Agriculture Department， Hetao College， Bayannaoer， Inner Mongolia 015000， China）Abstract： Through transparent circle method and molybdenum antimony colorimetric method，3 strains with good phosphorus-solubilizing effect were isolated and screened from the rhizosphere soil of; plants， in the experimental field of Linhe District of Bayannaoer City. The culture condition of strain was optimized by single factor test.The results showed that different carbon sources，nitrogen sources， temperature， pH and salt concentration had significant differences in their phosphorus removal effects. When PB1 used xylose as carbon source， ammonium nitrate as nitrogen source， NaCl concentration was 0.3 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. PB2 was most significant when fructose was used as carbon source， ammonium nitrate was used as nitrogen source， salt concentration was 0.7 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34 ℃， and liquid dosage was 50 mL. When PB3 used glucose or fructose as carbon source， sodium nitrate as nitrogen source， salt concentration was 0.5 g·L-1， pH is 6， temperature was 32 ℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. According to the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics， combined with the Manual for Identification of Common Bacterial Systems and Berger's Manual for Identification of Bacteria， the three strains were preliminarily identified as： PB1 was Salmonella， PB2 was Bacillus genus， and PB3 was Bacillus.Key words： Phosphate solubilizing Bacteria;medium optimization; phosphate dissol- ving ability磷是植物生長所必需的矿质元素，在植物生长、发育等生命活动中起着积极的作用。
一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用与流程
一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用与流程一、引言解磷菌是一种能够将有机磷转化为无机磷的微生物，解决了磷肥资源有限、磷污染等问题。
本文将介绍一种解磷菌及其菌剂的制备方法与应用与流程。
二、解磷菌及其菌剂的制备方法1. 菌株的筛选：通过野外土壤样品的采集与分离培养，筛选出具有解磷能力的菌株。
2. 菌株的纯化：通过连续传代和单菌分离，获得纯净的解磷菌株。
3. 菌株的培养基优化：通过改变培养基成分、pH值、培养温度等条件，优化解磷菌的生长和解磷能力。
4. 菌液的扩增：将纯净的解磷菌株接种到大规模培养罐中，进行菌液的扩增。
5. 菌剂的制备：将菌液进行离心、洗涤、浓缩等处理，制备成解磷菌剂。
三、解磷菌及其菌剂的应用与流程1. 解磷菌剂的应用范围：解磷菌剂广泛应用于农田、园林、果蔬种植等领域，能够提高土壤磷素利用率，减少磷素流失，改善土壤质量。
2. 解磷菌剂的施用方式：解磷菌剂可通过种子处理、土壤施用、冲施、叶面喷施等方式施用。
3. 解磷菌剂的施用量：根据不同作物和土壤类型，合理确定解磷菌剂的施用量，一般建议每亩施用量为50-100克。
4. 解磷菌剂的施用时间：解磷菌剂的最佳施用时间为播种前、移栽前或作物生长期初期。
5. 解磷菌剂的保存与贮存：解磷菌剂应存放在阴凉干燥处，避免阳光直射和高温，以保持菌剂的活力和效果。
四、解磷菌及其菌剂的作用机理1. 酸性磷酸酶的分泌：解磷菌能分泌酸性磷酸酶，将有机磷转化为无机磷，提供给作物直接利用。
2. 菌根促进作用：解磷菌能与作物根系共生，形成菌根，增加作物对磷的吸收能力。
3. 抑菌作用：解磷菌能分泌抑制土传病原菌的物质，减少作物病害发生。
4. 激活土壤磷素：解磷菌能够激活土壤中的固定磷，提高土壤磷素的有效性。
五、解磷菌及其菌剂的应用效果1. 提高作物产量：解磷菌剂的施用能够提高作物的磷素利用率，促进作物生长发育，增加产量。
2. 改善土壤质量：解磷菌剂的施用能够改善土壤结构，增加土壤养分含量，提高土壤肥力。
解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究
解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究作者：上官亦卿常帆吕睿齐凡贾凤安王艳丁浩来源：《湖北农业科学》2019年第01期摘要：为开发高效微生物解磷肥，利用解磷菌选择培养基（蒙吉娜卵磷脂培养基）从陕西省西安市周至县猕猴桃园农田土壤中分离出11株解磷菌，通过纯化培养，筛选出1株高效解磷菌JYP9。
利用16S rDNA基因序列分析方法对该菌株的分类信息进行鉴定，鉴定结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。
并用解磷圈法和液体摇瓶培养法，分别以卵磷脂为惟一磷源，确定了该菌株的最适培养温度为26 ℃、最适转速为200 r/min、最适起始pH为7和最适起始接种量为2%。
关键词：解磷菌;筛选;鉴定;最适条件中图分类号：S154.39; ; ; ; ;文献标识码：A文章编号：0439-8114（2019）01-0030-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2019.01.007; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Isolation，Screening，Identification and Phosphate Solubilizing Ability of Phosphate Solubilizing BacteriaSHANGGUAN Yi-qing1，2，CHANG Fan2，LYU Rui2，QI Fan1，JIA Feng-an2，WANG Yan2，DING Hao2（1.Shaanxi Academy of Sciences，Xi’an 710043，China;2.Microbial Metabolism Research Center，Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xi’an 710043，China）Abstract： In order to develop an efficient microbial fertilizer solution， 11 strains from the farm-land soil of actinidia park in Zhouzhi county， Shaanxi prvince， were isolated， using phosphate volubility bacteria selective culture medium （Mongolia lecithin culture medium）. A strain of phosphate volubility bacteria JYP9 was screened through purification cultivar. And classification information of this strain was identified by using 16S rDNA gene sequence analysis，the results showed that the strain was a Pseudomonas extremorientalis. Then the phosphate solubilizing method and the liquid shake flask method were used in the experiment to confirm the optimum cultivation condition of JYP9 with lecithin as the only phosphorus source. The results showed that the optimal temperature was 26 ℃， optimal rotational was 200 r/min， optimal pH was 7， and optimum initial inoculation amount was 2%.Key words： phosphate solubilizing bacteria; screen; identify; optimum condition磷是植物生长所需的一种主要营养元素，但植物对土壤中的磷元素利用率很低，严重影响着植物的生长[1]。
解磷菌株B25的筛选鉴定及其解磷能力-应用生态学报
解磷菌株B25的筛选、鉴定及其解磷能力*贺梦醒 高 毅 胡正雪 徐 瑶 龙 瑞 孙庆业**(安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601)摘 要 从安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼根际分离筛选出多株解磷细菌,经过多次筛选纯化获得一株解磷能力较好的菌株B25.采用透射电镜观察和DNA 分子技术,确定此菌株属于芽孢杆菌属.研究了解磷菌株B25在培养168h 内的解磷能力㊁溶液pH 值以及菌株生长量的变化情况,并比较了B25在不同条件下的解磷能力.结果表明:解磷菌株B25的解磷能力与溶液pH 值之间存在微弱的相关性,在碳源为葡萄糖㊁初始pH 值为7.0㊁培养温度为30℃时解磷效果较好.关键词 解磷菌 解磷能力 16S rRNA文章编号 1001-9332(2012)01-0235-05 中图分类号 Q939.96 文献标识码 A Screening ,identification ,and phosphate⁃solubilizing capability of phosphate⁃solubilizing bacterial strain B25.HE Meng⁃xing,GAO Yi,HU Zheng⁃xue,XU Yao,LONG Rui,SUN Qing⁃ye (School of Resources and Environmental Engineering ,Anhui University ,Hefei 230601,Chi⁃na ).⁃Chin.J.Appl.Ecol .,2012,23(1):235-239.Abstract :Various phosphate⁃solubilizing bacterial strains were isolated from the Hippochaete ramo⁃sissimum rhizosphere in Tongguanshan copper tailings in Tongling of Anhui Province,East China.After many times of screening and purification,a strain B25with stronger phosphate⁃solubilizing ca⁃pability was obtained,which belonged to Bacillus genus,as identified by transmission electron mi⁃croscope and DNA molecular approaches.A culture experiment was conducted to study the phos⁃phate⁃solubilizing capability of the B25within 168h and the variations of the medium pH and B25growth as well as the phosphate⁃solubilizing capability of B25under different culture conditions.A weak correlation was observed between the phosphate⁃solubilizing capability of B25and the medium pH.The B25displayed a better phosphate⁃solubilizing capability when the carbon source was glu⁃cose,medium initial pH was 7.0,and culture temperature was 30℃.Key words :phosphate⁃solubilizing bacteria;phosphate⁃solubilizing capability;16S rRNA.*国家高技术研究发展计划项目(2006AA06Z359)和安徽省自然科学基金项目(070415208)资助.**通讯作者.E⁃mail:sunqingye@ 2011⁃04⁃01收稿,2011⁃11⁃08接受. 磷素是植物生长所必需的三大营养要素之一.我国有74%的耕地土壤缺磷,土壤中95%磷为无效形式,为了获得高产每年都向土壤反复施加大量可溶性磷肥,然而由于土壤的固定等作用,作物对施入的磷肥当季节利用效率只有5%~10%,大部分与土壤中的Ca 2+㊁Fe 2+㊁Fe 3+㊁A13+结合形成难溶性磷酸盐[1].土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物,能够将难溶性的磷酸盐如磷矿粉转化为水溶性磷,提高土壤中的可溶性磷含量,从而改善植物磷素营养,提高作物产量[2-4].目前已报道的具有解磷能力的微生物包括细菌㊁真菌和放线菌[5-9]等,其中溶磷细菌的数量和种类较多,解磷真菌在数量上远不如解磷细菌多,其种类也少,主要局限于青霉(Penicillium )㊁曲霉(spergillus )㊁镰刀菌(Fusarium )㊁小丝核菌(Scleroti⁃um )等几个属种.林启美等[5]发现真菌的解磷能力比细菌强,有的可以达到10倍以上,并且许多细菌在进一步的纯化过程中容易失去解磷能力,而真菌则可以始终保持其解磷活力.不同种类的微生物,不仅解磷能力存在着巨大的差异,而且解磷机理也可能不一样.林启美等[5]发现,具有解磷能力的细菌,在培养期间,培养介质的酸度一般都降低;不具有解磷能力的微生物,其培养介质的pH 不仅不降低,反而升高.但是,培养介质的pH 与解磷能力之间并不存在显著的相关性.应用生态学报 2012年1月 第23卷 第1期 Chinese Journal of Applied Ecology,Jan.2012,23(1):235-239有学者认为[10-11],微生物的解磷能力可能与微生物分泌有机酸类物质有关,也可能存在多个解磷机理.解磷细菌中芽孢杆菌属的筛选以及解磷效果的研究在国内外已多有报道[11-15],但对解磷能力的理解均存在一定差异.本文从安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼根际土壤中分离筛选出具有解磷能力的多株细菌,其中以细菌B25解磷效果最佳,对其进行了菌种的鉴定,并对其解磷能力㊁解磷过程中菌体生长量㊁pH值变化情况以及不同条件下解磷能力情况进行了初步研究,以期为利用解磷菌提高尾矿磷素利用效率提供理论依据.1 材料与方法1.1 供试样品与培养基采集安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼(Hipp⁃ochaete ramosissimum)根际土壤.采用抖土法将收集的土样放入密封袋内立刻带回实验室冷藏,备用.分离培养基[16]:葡萄糖10g,磷矿粉5g, (NH4)2SO40.1g,KCl0.2g,MgSO4㊃7H2O 0.25g,MgCl2㊃6H2O5g,琼脂20g,定容至1000mL,pH7.0~7.5.种子培养基(LB):蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,琼脂18g(固体),定容至1000mL, pH7.0~7.5.1.2 解磷菌的分离㊁筛选与纯化取10g木贼根际土加入100mL无菌水震荡5min,将土壤悬浊液倒入250mL无菌三角瓶中, 25℃摇床振荡30min,取上清液逐级稀释至10-1㊁10-2㊁10-3㊁10-4㊁10-5㊁10-6㊁10-7和10-8,各取0.1mL 涂布于平板培养基上,每个浓度重复3次,30℃培养168h,挑取有明显溶磷圈的菌落纯化5次以上,将单菌落转至斜面培养基,直至菌落长起,置于4℃冰箱保存,备用.1.3 解磷菌株的鉴定通过透视电镜观察其细胞形态,并以16S rRNA[17](27F:5′⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3′和1492R:5′⁃TGACTGACTGAGGYTACCTTGT⁃TACGACTT⁃3′)的保守型序列为引物进行PCR扩增,扩增产物回收㊁克隆㊁测序后,将所得序列与BLAST数据库进行同源性分析,进行菌株鉴定.1.4 培养168h内解磷菌解磷能力㊁pH值㊁菌体生长量测定将分离得到的单株纯菌株在种子培养基中活化,按照1%的接种量接入上述分离培养基中(不含琼脂),并设置对照(CK),每个处理重复3次, 30℃㊁150r㊃min-1培养168h.每天取样检测培养液pH值(用pH计直接测定)㊁细菌生长量(OD600值).将培养液4℃6000r㊃min-1离心10min取上清液测磷含量,菌体1×105Pa灭菌30min,H2SO4⁃H2O2消煮后,均用钼锑抗比色法[18]测定发酵液以及菌体中可溶性磷含量.1.5 不同条件对解磷菌解磷能力的影响试验1.5.1碳源对菌株解磷能力的影响试验 分别用淀粉㊁蔗糖以及葡萄糖作为分离培养基中碳源,每个处理3个重复,以接灭活菌为对照.相同条件培养168h,每天取样检测有效磷含量.1.5.2培养基初始pH值对菌株解磷能力的影响试验 灭菌前分别将分离培养基初始pH值调至6.0㊁7.0㊁8.0,每个处理3个重复,以接灭活菌为对照.相同条件培养168h,每天取样检测有效磷含量.1.5.3温度对菌株解磷能力的影响试验 将接种后摇瓶培养的分离培养基分别置于20㊁30㊁40℃温度下,每个处理3个重复,以接灭活菌为对照.相同条件培养168h,每天取样检测有效磷含量.1.6 数据处理用SPSS软件对试验数据进行相关分析,采用Microsoft Excel2003软件作图.2 结果与分析2.1 解磷菌的分离㊁筛选与鉴定无机磷培养基平板初次筛选得到22株解磷细菌,通过多次筛选和纯化使一部分菌株失去或降低了解磷能力,最终筛选出一株解磷能力稳定且较好的菌株,命名为B25.据Kucey[19]报道,在菌株纯化过程中有近50%的解磷细菌会失去解磷能力,而大部分解磷真菌则可始终保持解磷活性.林启美等[5]在测定磷细菌的解磷能力时也发现,59株有机磷细菌中仅有6株表现出较强的解磷能力,部分无机磷菌株在分离纯化后失去解磷活力.透射电镜观察B25发现(图1),菌株B25菌体细胞杆状㊁末端方;成短链㊁中生㊁孢囊无明显膨大;革兰氏阳性㊁无荚膜㊁菌落大㊁扁平,初步认为是芽孢类菌属. 采用分子生物学方法进一步对解磷细菌B25进行遗传学鉴定,即提取B25的基因组DNA并对其核糖体的16S rRNA保守型序列进行PCR扩增. PCR扩增产物切胶回收㊁克隆㊁测序并用DNAStar分析软件将其序列与GenBank中近缘种序列进行同632应 用 生 态 学 报 23卷源性比对,结果表明菌株B25基因序列与GU297610(Bacillus anthracis strain U13)㊁EF062509(Bacillus sp.MCCB 101)和AM778997(Bacillus thuringiensis 16S rRNA gene and 16S⁃23S IGS)有较高的同源性,相似度均为99%,因此可以确定菌株B25归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(图2).2.2 解磷细菌B25在培养168h 内解磷能力的变化培养168h 内,对照组CK的解磷能力变化很图1 解磷菌株B25的透射电镜图Fig.1 Transmission microscope of phosphate⁃solubilizing strainB25.图2 解磷菌株B25的同源性分析Fig.2 Homological analysis of phosphate⁃solubilizing strainB25.图3 解磷细菌B25在168h 内的溶磷量Fig.3 Dissolution of phosphorous by phosphate⁃solubilizing strain B25in 168hours (mean±SD).小,维持在0.81~0.84mg㊃L -1,解磷细菌B25表现出了较强的解磷能力.在168h 内随着培养时间的延长,解磷菌株B25的解磷能力表现出先增长,并于第96小时达到最大值75.23mg㊃L -1,再下降而后趋于稳定的趋势(图3).表明该菌株在培养的前96h 内解磷能力较好,而后期可能由于碳源等营养物质的耗竭㊁以及菌体生长繁殖受到抑制等,使解磷能力有所降低.2.3 解磷过程中溶液pH 值㊁菌体生长量变化本研究中对照组(CK)培养液的pH 值未发生明显变化,维持在7.5左右,解磷细菌B25的培养液pH 值出现了明显的降低,第168小时降至6.27,呈酸性.将溶液pH 值和解磷细菌B25解磷能力做相关性分析,结果发现两者之间存在一定的相关性,但没有达到显著水平(P >0.05).在培养前120h 内,解磷细菌B25生长量不断增加(图4),并在第120小时达到最大值(OD 600=0.536),而后开始下降并趋于稳定.解磷细菌B25的生长量在第120小时出现最大值,而磷的释放在第96小时达到最大值,表明菌体的解磷能力与其生长状况并非一致,将菌体生长量OD 600值和解磷细菌B25的解磷能力做相关性分析,结果也表明两者之间无相关性(P >0.05). 前人研究表明,解磷菌解磷机理具有多样性[20-23],现在还不完全清楚,其中解磷菌产生和释放有机酸是最常见的一种机制,这些酸既能降低pH 值,又可与铁㊁铝㊁钙等离子螯合,从而使难溶磷或不溶性磷转化为有效磷.本研究发现,在培养的168h 内,B25的解磷能力不同,而且解磷量与培养液pH 值仅呈现出微弱的负相关性,这与Asea 等[10]报道pH 值与解磷量之间缺乏相关性或仅有微弱的相关性相一致.林启美等[5]发现培养介质酸度升高是溶图4 培养过程pH 值和光密度变化Fig.4 Changes of the culture pH and OD 600of phosphate⁃solu⁃bilizing strain B25(mean±SD).7321期 贺梦醒等:解磷菌株B25的筛选㊁鉴定及其解磷能力 解磷矿粉的重要条件,但不是必要条件.Illmer 和Schitnner [11]认为,产有机酸只是解磷的一个方面,而伴随着呼吸或同化NH 4+时H +的释放是解磷的另一个重要机制.杨慧等[24]研究表明,溶磷草生欧文氏菌的溶磷量与培养液pH 下降无直接关系,可能在培养过程中溶磷菌除有机酸外还分泌一些非有机酸物质,也许还存在其他的解磷机理,甚至微生物在不同的生长时期,其解磷机理可能发生转变.可见,关于微生物的解磷机理还有待进一步研究.2.4 不同培养条件下解磷菌株B25解磷效果2.4.1碳源 由图5可知,解磷菌株B25在不同碳源条件下解磷效果存在细微差别,3种碳源培养基的解磷效果依次为淀粉>葡萄糖>蔗糖,尽管三者的解磷趋势基本一致,但从图5可明显地看出,前期(24~120h)的增长以及后期(120~168h)的下降.以淀粉为碳源的解磷菌株B25的解磷能力均表现图5 解磷菌株B25在不同碳源(a)㊁pH 值(b)和温度(c)下的溶磷量Fig.5 Phosphate solubilization capacity of phosphate⁃solubiliz⁃ing strain B25under different carbon sources (a),pH values(b)and temperatures (c)(mean±SD).G:葡萄糖Glucose;Z:蔗糖Sucrose;D:淀粉Starch.出较大增幅.葡萄糖为碳源条件下的B25解磷能力前期增长幅度较慢,第96小时开始跃增并于第120小时达最大值,后期解磷能力虽在下降但均大于淀粉和蔗糖,对于168h 的培养周期,以选择葡萄糖作为碳源为佳.2.4.2初始pH 值 解磷菌株B25在不同pH 值条件下解磷效果存在显著差异(图5).初始pH 值为7.0时解磷菌株B25的解磷效果最好,在24~96h 的前期培养中,其解磷能力的增长幅度低于pH 8.0和6.0,第120小时跃增至最大值,第144㊁168小时虽有所下降,但也维持相对较好的解磷能力.在整个培养过程中,初始pH 值为8.0和6.0的解磷效果变化较小,一直处于较低状态,解磷菌株B25的最适初始pH 值为7.0.2.4.3温度 解磷菌株B25在不同温度条件下解磷效果存在一定差异,其中20㊁30℃条件下解磷菌株B25的解磷效果明显高于40℃.在前期(24~96h)的培养过程中,30℃条件下解磷效果的增长幅度大于20℃,第120小时跃增至最大值,而后开始降低.20℃条件下解磷菌株B25的解磷效果处于中间水平,解磷趋势与30℃相一致(图5).40℃条件下解磷菌株B25的解磷效果一直处于较低状态,且变化情况不明显.可知该菌株的最适宜温度为30℃.3 结 论采用以磷矿粉为唯一磷源的选择性培养基,从木贼根际分离筛选出多株解磷细菌,大多数菌体在不断地纯化过程中解磷能力失去或降低,而菌株B25的解磷能力较强.经过透射电镜和分子鉴定,确定此菌株为出芽孢杆菌属细菌;解磷菌株B25的解磷能力与溶液pH 值之间存在微弱的相关性㊁与菌株生长量无相关性;菌株表现最佳解磷效果时的最佳碳源是葡萄糖㊁最适初始pH 值是7.0㊁最适培养温度是30℃.参考文献[1] Zhao X⁃R (赵小蓉),Lin Q⁃M (林启美).Reviewabout P⁃solubilization by microbes.Soils and Fertilizers (土壤肥料),2001,5(3):7-11(in Chinese)[2] Peix A,Rivas⁃Boyero AA,Mateos PF,et al .Growthpromotion of chickpea and barely by a phosphate solubi⁃lizing strain of Mesorhizobium mediterraneum under growth chamber conditions.Soil Biology and Biochemis⁃try ,2001,33:103-110[3] Vassileva M,Azcon R,Barea JM,et al .Effect of en⁃capsulated cells of Enterobacter sp.on plant growth and832应 用 生 态 学 报 23卷phosphate uptake.Bioresource Technology,1999,67:229-232[4] Zaidi A,Khan MS,Amil M.Interactive effect of rhi⁃zotrophic microorganisms on yield and nutrient uptake ofchickpea(Cicerarietinum L.).European Journal of Ag⁃ronomy,2003,19:15-21[5] Lin Q⁃M(林启美),Zhao X⁃R(赵小蓉),Sun Y⁃X(孙炎鑫),et munity characters of soil phos⁃phobacteria in four ecosystems.Soil and EnvironmentalSciences(土壤与环境),2000,9(1):34-37(in Chi⁃nese)[6] Reddy MS,Kumar S,Babita K,et al.Biosolubilizationof poorly soluble rock phosphates by Aspergillus tubin⁃gensis and Aspergillus niger.Bioresource Technology,2002,84:187-189[7] Zhao X⁃R(赵小蓉),Lin Q⁃M(林启美),Sun Y⁃X(孙焱鑫),et al.Phosphobacteria distribution in rhizo⁃phere and nonrhizosphere soil of winter wheat.Acta Ag⁃riculturae Boreali⁃Sinica(华北农学报),2001,16(1):111-115(in Chinese)[8] Li W⁃H(李文红),Shi J⁃Y(施积炎).Isolation,pur⁃ification,and phosphate⁃solubilizing capability of phos⁃phorous bacteria in West Lake sediment.Chinese Jour⁃nal of Applied Ecology(应用生态学报),2006,17(11):2112-2116(in Chinese)[9] Zhu P⁃M(朱培淼),Yang X⁃M(杨兴明),Xu Y⁃C(徐阳春),et al.High effective phosphate⁃solubilizingbacteria:Their isolation and promoting effect on cornseedling growth.Chinese Journal of Applied Ecology(应用生态学报),2007,18(1):107-112(in Chinese) [10] Asea PEA,Kucey RMN,Stewart JWB.Inorganic phos⁃phate solubilization by two Penicillium species in solu⁃tion culture and soils.Soil Biology and Biochemistry,1988,20:459-464[11] Illmer P,Schinner F.Solubilization of inorganic calciumphosphates⁃solubilization mechanisms.Soil Biology andBiochemistry,1995,27:257-263[12] Vazquez P,Holguin G,Puente ME.Phosphate⁃solubi⁃lizing microorganisms associated with the rhizosphere ofmangroves in a semiarid coastal lagoon.Biology andFertility of Soils,2000,30:460-468 [13] Behbahani M.Investigation of biological behavior andcolonization ability of Iranian indigenous phosphate solu⁃bilizing bacteria.Scientia Horticulturae,2010,124:393-399[14] Fang T⁃T(方亭亭),Deng G⁃F(邓桂芳),Liu H⁃Z(刘华中),et al.Filtration and identification of thebacteria for decomposing phosphorite powder.Journal ofHubei University for Nationalities(Natural Science)(湖北民族学院学报㊃自然科学版),2010,28(1):30-32(in Chinese)[15] Zhong C⁃Q(钟传青),Huang W⁃Y(黄为一).Effectsand mechanism of P⁃solubilizing bacillus P17strain onphosphorus solubilization of different phosphate rocks.Acta Pedologica Sinica(土壤学报),2004,41(6):931-937(in Chinese)[16] Nautiyal CS.An efficient microbiological growth mediumfor screening phosphate solubilizing microorganisms.FEMS Microbiology Letters,1999,170:265-270 [17] Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,et al.16S ri⁃bosomal DNA amplification for phylogenetic study.Jour⁃nal of Bacteriology,1991,173:697-703 [18] Lu R⁃K(鲁如坤).Analyse Methods of Soil and Agro⁃chemistry.Beijing:China Agricultural Science andTechnology Press,1999(in Chinese) [19] Kucey RMN.Phosphate solubilizing bacteria and fungiin various cultivated and virgin Alberta soils.CanadianJournal of Soil Science,1983,63:671-678 [20] Chen YP,Rekha PD,Arun AB,et al.Phosphate solu⁃bilizing bacteria from subtropical soil and their tricalci⁃um phosphate solubilizing abilities.Applied Soil Ecolo⁃gy,2006,34:33-41[21] Goldstein AH,Rogers RD,Mead G.Mining by mi⁃crobe:Separating phosphate from ores via bioprocess⁃ing.Bioresource Technology,1993,11:1250-1254 [22] Sun C⁃X(孙彩霞),Chen L⁃J(陈利军),Wu Z⁃J(武志杰).Persistence of Bt toxin in soil and its effects onsoil phosphatase activity.Acta Pedologlca Sinica(土壤学报),2004,41(5):761-765(in Chinese) [23] Rodríguez H,Gonzalez T,Selman G.Expression of amineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbi⁃cola in two rhizobacterial strains.Journal of Biotechnolo⁃gy,2000,84:155-161[24] Yang H(杨 慧),Fan B⁃Q(范丙全),Gong M⁃B(龚明波),et al.Isolation and identification of a novelphosphate⁃dissolving strain P21.Acta MicrobiologicaSinica(微生物学报),2008,48(1):51-56(in Chi⁃nese)作者简介 贺梦醒,女,1985年生,硕士研究生.主要从事环境微生物学研究.E⁃mail:mengxing198520@责任编辑 肖 红9321期 贺梦醒等:解磷菌株B25的筛选㊁鉴定及其解磷能力 。
解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究
收稿日期:2018-10-15作者简介:上官亦卿(1987-),男,陕西西安人,研究实习员,主要从事土壤微生物及其代谢产物的研究工作,(电话)135********(电子信箱)67900144@;通信作者,吕睿,助理研究员,主要从事土壤微生物及其代谢产物研究,(电子信箱)394700159@。
,,,.、、[J].,2019,58(1):30-34,38.磷是植物生长所需的一种主要营养元素,但植物对土壤中的磷元素利用率很低,严重影响着植物的生长[1]。
有机磷是土壤磷的重要组成部分,一般占土壤全磷的20%~50%,其中植酸磷占有机磷的10%~50%[2],是土壤有机磷的主要存在形式。
解磷菌能将植物难以吸收利用的难溶性或不溶性磷转化为可利用的形态,提高土壤中磷素的利用效率,减少化学肥料的施用,降低农业投入成本。
因此,对土壤环境进行微生物修复是提高作物产量、解决土壤速效磷缺乏的重要途径之一[3,4]。
存在于土壤中的根际细菌、内部共生细菌被认为是最有效的解磷微生物,它们能够利用自身的代谢物质[5]、通过NH 4+同化作用[6]或释放H 2S [7]将被土壤固定的无效态磷释放出来。
这些细菌能够将被土壤固定的矿物态磷释放出来,但是其在植物根际的数量不足以与其他微生物竞争,难以挥发其活性,因此筛选出具有高效溶磷能力的菌株,并将其添加到生物有机肥中,以供给作物充足的磷素显得尤为重解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究上官亦卿1,2,常帆2,吕睿2,齐凡1,贾凤安2,王艳2,丁浩2(1.陕西省科学院,西安710043;2.陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,西安710043)摘要:为开发高效微生物解磷肥,利用解磷菌选择培养基(蒙吉娜卵磷脂培养基)从陕西省西安市周至县猕猴桃园农田土壤中分离出11株解磷菌,通过纯化培养,筛选出1株高效解磷菌JYP9。
利用16S rDNA 基因序列分析方法对该菌株的分类信息进行鉴定,鉴定结果表明该菌株为假单胞菌(Pseudomonas extremori⁃entalis )。
桉树根际土壤解磷细菌的分离、筛选及其解磷效果
桉树根际土壤解磷细菌的分离、筛选及其解磷效果徐欢;俞新玲;林勇明;吴承祯;谢安强;陈灿;李键;洪滔【摘要】To develop microbial compound fertilizer for Eucalyptusplantation, rhizosphere phosphorus ( P ) bacteria were separated and selected from the soil of Eucalyptus salignai, E. Dunnii and E. urophglla×grandis by selective medium. Then strains with most stable solubilizing capacity were further screened. Results showed that there existed about 2. 23 × 104~4. 17 × 104 cfu · g-1 organic phosphate-solubilizing bacteria and 2.05×104~4.00×104 cfu·g-1 inorganic phosphate-solubilizing bacteria in 3 kinds of forest soils. The quantity of bacteria from different stands in a descending order was Eucalyptus saligna, E. urophglla×E.grandis and E. Dunnii. Phosphate solubilizing capacities varied significantly among 12 strains of organic phosphate-solubilizing bacteria and 14 strains of in-organic phosphate-solubilizing bacteria (P<0.05), with available P absorbed by inorganic phosphate-solubilizing bacteria ranging from 55.854 to 367.169 g·mL-1 , and available P dissolved by organic phosphate-solubilizing bacteria ranging from 11.374 to 30. 330 g·mL-1 . There was significantly negative relationship between pH of culture solution and the content of inorganic P solubi-lized by inorganic phosphate-solubilizing bacteria, though pH was not correlated with the content of organic P dissolved by organic phosphate-solubilizing bacteria. Among 26 strains, strain P7 demonstrated the highest capacity in solubilizing inorganic P and strain YP8 was the most efficient in dissolvingorganic P, which were recommended as microbial fertilizer for Eucalyptus species.%采用选择性培养基对柳桉、邓恩桉和尾巨桉3种桉树林地根际土壤解磷细菌进行分离和筛选,并对其解磷能力进行测定.结果表明:(1)3种林分根际土壤中均存在大量的解磷细菌,其中的解有机磷细菌数量为(2.23~4.17)×104 cfu·g-1,溶无机磷细菌数量为(2.05~4.00)×104 cfu·g-1,解有机磷细菌数量多于溶无机磷细菌数量.不同林分根际土壤解磷细菌数量分布有差异,其数量大小为:柳桉>尾巨桉>邓恩桉.(2)筛选到12株溶无机磷细菌和14株解有机磷细菌,且不同解磷细菌的解磷能力存在显著差异(P<0.05).12株溶无机磷细菌在无机磷培养液中的有效磷含量为55.854~367.169μg·mL-1,最大为P7菌株;14株解有机磷细菌在有机磷培养液中的有效磷含量为11.374~30.330μg·mL-1,最大为YP菌株.溶无机磷细菌溶解的无机磷含量与蒙金娜无机磷培养基的pH之间存在极显著负相关性(P<0.01),解有机磷细菌分解的有机磷含量与卵黄培养基的pH之间无显著相关性(P>0.05).综上所述,26株解磷细菌中,P7菌株溶解无机磷的能力最强,YP8菌株分解有机磷的能力最强,这两个菌株可作为下一步研制桉树微生物肥料的重点菌种.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(045)005【总页数】7页(P529-535)【关键词】桉树;解磷细菌;溶磷能力;有效磷【作者】徐欢;俞新玲;林勇明;吴承祯;谢安强;陈灿;李键;洪滔【作者单位】福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;武夷学院生态与资源工程学院,福建南平354300;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S718.81磷元素是植物生长过程中必需的三大营养元素之一，其含量的高低与植物的生长发育和新陈代谢密切相关.然而，我国75%的耕地土壤缺磷，且土壤中95%的磷以无效磷的形式存在，不能直接被植物吸收利用[1].在农业生产上往往采用施加大量磷肥来补给土壤中磷元素的缺失，但磷肥极易与土壤中的Ca2+、Al3+、Fe2+和Fe3+螯合形成难溶性磷酸盐，无法被植物吸收利用，且化肥的过度使用会破坏土壤结构，污染环境[2-3].可见，研究土壤中被固定的无效态磷的分解和释放，对于提高土壤中的可溶性磷含量、调节土壤肥力及科学合理施肥具有重要意义.植物根际土壤中存在大量具有不同解磷能力的微生物，这类微生物可以通过自身代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难溶性无机磷，增加土壤中的有效磷含量，从而提高土壤磷含量[4-5].Sperber[6]发现，植物根际土壤的解磷细菌不仅可提高根际土壤的磷含量，对植物根系的生理代谢过程也有促进作用；Zhao et al[7]从杨树根际土壤中分离出大量的溶磷菌株，发现DZ-18菌株的解磷效果最好；马文文等[8]从7种禾草根际土壤中分离筛选得到2株具有高效解磷能力的菌株PCRP5和MCMRS4；王浩等[9]从豆科植物根际土壤中分离得到47株对溶液中磷酸三钙均有很好溶解效果的溶磷菌；Hussain et al[10]从玉米根际土壤中分离筛选的PS-01菌株不仅有较强的解磷能力，还对玉米的生长具有促进作用.以上研究表明，从植物根际土壤中筛选得到具有高效解磷能力的菌株可缓解土壤磷素缺乏的问题.但目前我国学者关于植物根际解磷细菌的研究主要针对农田和草地两种生态系统，而对人工林生态系统植物解磷细菌的研究较少.桉树自引进中国以来，种植规模不断扩大，因其速生、高产及短期可采伐的优点，现已成为我国南方人工林造林的主要建树树种之一[11].桉树的速生特性对土壤中的磷元素消耗大，长期种植桉树后林地的土壤肥力严重衰退，导致产量下降[12-13].为解决这一问题，开展桉树根际土壤解磷微生物的分离和筛选工作势在必行.因此，本试验以邓恩桉(Eucalyptus dunnii)、柳桉(E.saligna)和尾巨桉(E.urophglla×E.grandis)3种桉树林地为研究对象，研究桉树根际土壤解磷微生物的解磷能力，以期筛选出优良的解磷菌株，为提高桉树人工林的产量及研制微生物复合肥提供理论依据.1.1 材料1.1.1 研究区概况研究区位于福建省永安国有林场(N25°56′27″、E117°23′18″).该林场属典型的亚热带季风山地气候，年平均气温19.1 ℃，平均降雨量1 688 mm.林地土壤质地以红壤为主，其次为黄壤.林场种植大面积的人工植被，如杉木(Cunninghamia lanceolata)、毛竹(Phyllostachys edulis)、尾巨桉和马尾松(Pinus massomiana Lamb.)等.1.1.2 土样采集采集永安国有林场柳桉、尾巨桉和邓恩桉3种桉树林地的根际土壤，试验区林地的基本特征如表1所示.采取5点取样法对3块标准地采样，去除表土，取10～20 cm深度的根际土壤500 g，装袋并记录采集地点、日期和土样号，取回实验室置冰箱(4 ℃)中保存.1.1.3 培养基采用蒙金娜无机磷培养基分离溶无机磷细菌，采用卵黄培养基分离解有机磷细菌，采用牛肉膏蛋白胨培养基保存和活化菌株.各培养基组成和配方见文献[14-16].1.2 解磷细菌的分离与纯化准确称取5 g土壤样品到装有95 mL无菌水的250 mL三角瓶中，于25 ℃摇床振荡30 min，静置20～30 s，取上清液按十倍稀释法制成10-4、10-5、10-6一系列稀释菌液.各取3种稀释浓度样品0.1 mL涂布于卵黄平板培养基和蒙金娜无机磷平板培养基上，每个浓度重复3次.解有机磷细菌于28 ℃的恒温培养箱中培养3 d，溶无机磷细菌培养7 d，同时记录具有透明圈的菌落个数.培养结束后，用接种环挑取有明显透明圈的菌落，采用划线法纯化5次以上，将纯化后的单菌落转至斜面培养基上，保存于冰箱(4 ℃)中备用.1.3 解磷能力的测定1.3.1 定性分析将分离纯化后的菌株分别点植于蒙金娜无机磷培养基和卵黄培养基上，置于培养箱(28 ℃)中，溶无机磷细菌培养7 d，解有机磷细菌培养2 d，观察并测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)，计算D与d的比值.1.3.2 定量分析分别在150 mL三角瓶中加入蒙金娜无机磷液体培养基和卵黄液体培养基，每瓶30 mL，高温灭菌20 min(121 ℃、1.01 Pa)后备用.提取已在牛肉膏蛋白胨培养基上活化24 h的菌液，在蒙金娜无机磷液体培养基和卵黄液体培养基中各加1 mL，以加1 mL无菌水为对照，每个处理重复3次，摇床培养(28 ℃、160 r·min-1)5 d.培养完毕后，发酵液于4 ℃、10 000 r·min-1离心20 min，取上清液定容至50 mL，于37 ℃水浴1 h，再于4 ℃、10 000 r·min-1离心20 min，取上清液定容至50 mL，采用钼锑抗比色法[9]测定两次离心后上清液的磷含量.第1次上清液的测定结果表示培养液中的有效磷含量，第2次上清液的测定结果表示菌体所吸收的磷含量.培养基的pH用酸度计测定.1.4 数据分析试验数据以平均值±标准差表示，采用Excel和SPSS 19.0软件对数据进行处理，利用邓肯氏新复极差法进行方差分析，菌株溶磷能力与pH之间的相关性采用Pearson软件分析.2.1 不同桉树根际土壤解磷细菌的数量邓恩桉、柳桉和尾巨桉3种林分类型的根际土壤中均存在大量解有机磷细菌和溶无机磷细菌，以柳桉林磷细菌的总量最多，其他依次为尾巨桉林和邓恩桉林，柳桉林的溶无机磷细菌和解有机磷细菌数量均与其他两种林型存在显著差异(表2).在3种林分类型的根际土壤中，除邓恩桉林解有机磷细菌的数量大致与溶无机磷细菌数量相等外，其他两种林型均为解有机磷细菌数量大于溶无机磷细菌数量.2.2 固体培养基上解磷细菌的解磷能力D/d可作为初步判断解磷细菌相对解磷能力的一个指标.根据D/d的大小，从蒙金娜无机磷平板培养基和卵黄平板培养基上各筛选出D/d大于1.0的溶无机磷细菌和解有机磷细菌各30株，并进行编号，溶无机磷细菌编号为P1～P30，解有机磷细菌编号为YP1～YP30.结果(表3)表明：30株溶无机磷细菌的解磷能力存在显著差异(P<0.05).解磷能力较强的(D/d>2)有7株，占总数的20.33%；解磷能力强的(2.0<D/d<1.5)有17株，占总数的56.67%；解磷能力一般的(1.5<D/d<1.0)有6株，占总数的20.00%.30株解有机磷细菌的解磷能力与溶无机磷细菌类似，也存在显著差异(P<0.05).解磷能力较强的(D/d>2)有12株，占总数的40.00%；解磷能力强的(2.0<D/d<1.5)有10株，占总数的33.33%；解磷能力一般的(1.5<D/d<1.0)有8株，占总数的26.67%.2.3 液体培养基上解磷细菌的解磷能力对初步筛选获得的60株解磷细菌进行液体培养，部分解磷细菌在多次纯化和复筛过程中失去了解磷能力，最终筛选得到26株解磷能力稳定的菌株，其中，溶无机磷细菌12株，解有机磷细菌14株.2.3.1 溶解无机磷的能力表4表明，12株溶无机磷细菌在液体摇瓶中均表现出较强的解磷能力.从菌体自身所吸收的磷含量来看，在12株溶无机磷细菌中，P7菌株在培养液中吸收的可溶性磷含量最大，达29.162 μg·mL-1；其次是P5、P26和P28菌株，分别为17.887、17.572和10.252 μg·mL-1；其余菌株自身吸收的磷含量均在10.00 μg·mL-1以下.从菌株溶解有效磷的含量来看，所有接种处理培养液中的有效磷含量均高于CK，表明各菌株对磷酸三钙均有一定的溶解作用.12株溶无机磷细菌接种处理培养液中的有效磷含量为55.854～367.169 μg·mL-1，增幅是CK的10.190～66.989倍，各菌株间溶磷效果的差异极显著(P<0.01).其中，P7菌株的解磷能力最强，该菌株接种处理的培养液中有效磷含量达367.169 μg·mL-1，其次是P8和P19菌株，分别为265.397 和235.614 μg·mL-1，这3个菌株在固体培养基上也表现出较强的解磷能力.而在固体培养基上有较高D/d的P29和P30菌株在液体培养基中的解磷能力仅分别为77.145和55.854 μg·mL-1.相对于未接种的培养液(pH 6.73)，12株溶无机磷细菌接种处理的培养液pH均有不同程度的下降，各处理液的pH为4.26～5.03，降幅为1.70～2.47.其中，P7菌株接种处理的培养液pH最低，为4.26，但该菌株的溶磷量最高；P29和P30菌株接种处理的培养液pH分别为5.03和4.98，两个菌株的溶磷量较低.利用相关性回归方程进一步分析菌株溶磷量与pH的相关性发现，12株溶无机磷细菌的溶磷量与pH之间存在极显著相关性(P<0.01)，线性回归方程为：y=-277.650x+1 445.900，R2=0.647 4.2.3.2 分解有机磷的能力表5表明，14株解有机磷细菌在液体摇瓶中也表现出一定的解磷能力.从菌体自身吸收的磷含量来看，在14株解有机磷细菌中，只有5株自身吸收的磷含量超过1.00 μg·mL-1，其中，YP25菌株最高，达1.398μg·mL-1，其余菌株自身吸收的磷含量均在1.00 μg·mL-1以下，各菌株吸收的磷含量之间存在极显著差异(P<0.01).从菌株分解有效磷的含量来看，14株解有机磷细菌虽也表现出一定的解磷能力，但其解磷能力远不及溶无机磷细菌.12株解有机磷细菌接种处理的培养液中有效磷含量为11.374～30.330 μg·mL-1，增幅是CK的2.130～5.680倍，各菌株间的解磷能力差异极显著(P<0.01).其中，YP8菌株的解磷能力最强，与其他菌株的差异达到显著水平(P<0.05)，而YP24菌株的解磷能力最弱.结合平板培养基试验结果，YP8菌株在两种不同的培养方式中均表现出很好的解磷能力.14株解有机磷细菌接种处理的培养液pH为7.92～8.25，与未接种的培养液pH 无明显差异.利用相关性回归方程进一步分析菌株溶磷量与pH的相关性发现，14株解有机磷细菌的解磷量与pH之间无显著相关性(P>0.05)，线性回归方程为：y=-27.325x+238.980，R2=0.242 1.本试验通过溶磷圈法和钼锑抗比色法对3种桉树林根际土壤解磷细菌进行筛选，并对其解磷能力进行测定，得到26株具有稳定解磷能力的菌株，但各菌株对磷酸三钙和卵磷脂的溶解能力差异较大.12株溶无机磷细菌溶解磷酸三钙的量为55.854～367.169 μg·mL-1，解磷能力最强的是P7菌株；14株解有机磷细菌分解卵磷脂的量为11.374～30.330 μg·mL-1，解磷能力最强的是YP8菌株.P7和YP8菌株可作为研制微生物肥料的重点菌株.溶无机磷细菌溶解的无机磷含量与培养液pH之间存在显著负相关性，解有机磷细菌分解的有机磷含量与培养液pH之间无显著相关性.目前只是初步探讨P7和YP8菌株的解磷效果和解磷机制，以后有望进一步开展两个菌株对桉树的长期接种效应及其促生机制的研究.植物根际土壤解磷微生物不仅可将土壤中的难溶性磷转化为可溶性磷以供植物吸收利用，还可通过分泌生长调节物质和提高植物对其他营养元素的吸收利用能力等方面促进植物生长.植物根际土壤解磷微生物的数量与植物所处区域的植被类型、水热状况和土壤肥力密切相关[8].就植被类型对植物根际土壤解磷微生物的影响而言，有研究发现植物根系可向生长环境中分泌有机物以供磷细菌生长，根系分泌物数量会直接影响磷细菌的数量.由于不同类型植物的根系分泌物数量不同，导致不同植被类型其根际土壤微生物数量的差异[17].臧威等[18]研究大豆、玉米、小麦和水稻4种农作物根际土壤磷细菌数量发现，玉米根际土壤磷细菌数量最多，水稻最少，但各作物根际土壤磷细菌数量分布差异未达到显著水平(P>0.05).本试验结果表明，3种桉树林地根际土壤中均存在大量的磷细菌，磷细菌数量分布大小为：柳桉>尾巨桉>邓恩桉，这与臧威等的研究结果[18]相似.产生这种差异的原因可能是由于不同品种桉树的根系分泌物数量存在差异所致.3种桉树林地根际土壤中磷细菌的数量、分布均为解有机磷细菌多于溶无机磷细菌，这可能是由于林地土壤有较厚的枯枝落叶层，丰富的有机物为解有机磷细菌的生长提供更有利的营养环境.目前，测定解磷细菌的解磷能力一般是通过测量固体培养基上菌落周围溶磷圈的大小来判断菌株解磷能力的强弱，但许多研究表明，溶磷圈大小与菌株解磷能力呈弱相关关系[19].部分解磷细菌在固体培养基上无溶磷圈产生，但经过液体培养，也能表现出一定的解磷能力.因此，固体培养基上解磷细菌溶磷圈的大小以及D/d只能定性地反应菌株的解磷能力，要精确地了解解磷细菌解磷能力的强弱，需采用液体培养法对菌株的解磷能力进行定量分析.本试验中，12株溶无机磷细菌和14株解有机磷细菌在固体培养基上测定的D/d与液体培养上测定的解磷能力不成正比，即在固体培养基上D/d较小的菌株，在液体培养阶段却有较强的解磷能力，而在固体培养基上有较大D/d的菌株，在液体培养阶段解磷能力减弱，溶液中有效磷含量也显著低于其他菌株，这与前人对玉米[20]和马尾松[21]解磷能力的研究结果相似.产生这种结果的原因，一方面可能是由于在配置平板培养基的过程中无法保证每个培养皿中含有相同体积的磷酸三钙或卵磷脂，因此各菌株所分解磷酸三钙或卵磷脂的量不同，导致各菌株在固体平板培养基上产生的溶磷圈大小也不一样[22]；另一方面可能是由两种培养方式所致，部分解磷细菌在液体培养方式下的生长繁殖速度比固体培养方式更快，菌株在液体培养方式的解磷能力也更强[20].解磷细菌在多次纯化的过程中，部分菌株的解磷能力随着纯化次数的增加而呈下降趋势，甚至消失.Kucey[23]发现解磷细菌在纯化的过程中有50%的菌株失去解磷能力；柯春亮等[24]筛选的8株溶无机磷细菌在纯化后，仅3株仍表现出稳定的解磷能力.研究表明，解磷细菌解磷能力的发挥受土壤中其他大量微生物(如固氮菌)的影响，这种影响表现为解磷细菌与其他微生物的协同作用[25].如磷细菌与固氮菌同时存在时，磷细菌通过提高土壤中的磷含量为固氮菌的生长繁殖提供磷源，固氮菌可通过自身分泌生理活性物质加速解磷细菌芽孢的萌发速度[26].本试验中，60株解磷细菌在纯化后，仅12株溶无机磷细菌和14株解有机磷细菌仍具有一定的解磷能力，与Kucey[23]和柯春亮等[24]的研究结果一致.产生这种现象的原因可能是，部分菌株通过与其他菌株形成类似共生的关系来表现出一定的解磷能力，而菌株之间这种相互促进的关系在纯化的过程中逐渐消失，从而导致部分菌株的解磷能力下降甚至丧失.解磷细菌在生长繁殖的过程中，不仅能分解环境中的难溶性磷，而且可将分解出来的磷同化后贮存在自身细胞中.赵小蓉等[27]研究发现，菌株本身会吸收培养液中溶解的磷用于自身的生长繁殖，忽视菌体吸收利用的有效磷含量，会低估某些菌株的实际解磷能力.陈阳等[28]利用溶菌酶对26株解磷芽孢杆菌的细胞进行破碎后发现培养液中的有效磷含量增加，表明各菌株在分解溶液中磷酸三钙的同时，自身也吸收同化部分溶液中分解的磷.因此，不能因为解磷细菌在液体培养基上测定的有效磷增量为负值而认为该菌株没有解磷能力，应该考虑菌体自身对分解的磷吸收同化的量，这样才能对菌株的解磷能力做出更准确的判断.本试验中，26株解磷细菌在液体培养过程中均吸收部分溶液中分解的磷贮存于菌体细胞中，这表明各菌株实际溶解磷酸三钙和卵磷脂的量多于溶液中测得的有效磷含量，这一结果证实了赵小蓉等[27]的结论.但不同菌株自身吸收同化的磷含量存在差异，出现这种差异的原因可能是由于不同菌株自身生长繁殖对养分需求不同.关于溶磷量与培养介质pH之间的关系，李蓉等[29]研究表明两者并没有显著的相关性，而乔志伟等[30]研究证明两者存在极显著负相关性，即培养介质的pH越低，培养液中的溶磷量越大，表明培养介质的酸度对溶磷量有很大影响.本试验结果表明，蒙金娜无机磷培养基的pH与溶无机磷细菌培养液中有效磷含量之间呈极显著负相关，卵黄培养基的pH与解有机磷细菌培养液中有效磷含量无显著相关性.这可能与不同类型解磷细菌的溶磷机制不同有关：溶无机磷细菌通过在生长过程中分泌出有机酸，或与NH4+同化作用释放H+，产生的酸既能溶解培养液中的难溶性磷，又能降低培养介质的pH[31]；而解有机磷细菌是通过分泌胞外磷酸酶等非有机酸类物质来分解有机磷脂，释放有机磷，其代谢产物对培养液的pH无显著影响[29].【相关文献】[1] 魏伟,吴小芹,乔欢.马尾松根际高效解磷真菌的筛选鉴定及其促生效应[J].林业科学,2014,50(9):82-88.[2] BHATTACHARYYA P N, JHA D K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture [J]. World Journal of Microbiol and Biotechnology, 2012,28(4):1 327-1 350.[3] ASLANTA R, ÇAKMAKÇI R, AHIN F. Effect of plant growth promoting rhizobacteria on young apple tree growth and fruit yield under orchard conditions [J]. Scientia Horticulturae, 2007,111(4):371-377.[4] 崔邢,张亮,林勇明,等.不同土壤条件下解磷菌处理对巨尾桉土壤有效磷含量的影响[J].应用与环境生物学报,2015,21(4):740-746.[5] AHEMAD M, KIBRET M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective [J]. Journal of King Saud University-Science,2014,26(1):1-20.[6] SPERBER J I. The incidence of apatite-solubilizing organisms in the rhizosphere and soil [J]. Crop and Pasture Science, 1958,9(6):778-781.[7] ZHAO L, WU X Q, YE J R, et al. Isolation and characterization of a mycorrhiza helper bacterium from rhizosphere soils of poplar stands [J]. Biology and Fertility of Soils, 2014,50(4):593-601.[8] 马文文,姚拓,蒲小鹏,等.东祁连山7种禾草根际溶磷菌筛选及其溶磷特性[J].草业科学,2015,32(4):515-523.[9] 王浩,姜妍,刘伟,等.大豆根际高效溶磷菌株的分离及溶磷能力分析[J].大豆科学,2014,33(3):404-407.[10] HUSSAIN M I, ASGHAR H N, AKHTAR M J, et al. Impact of phosphate solubilizing bacteria on growth and yield of maize [J]. Soil & Environment, 2013,32(1):71-78.[11] 杨尚东,吴俊,谭宏伟,等.红壤区桉树人工林炼山后土壤肥力变化及其生态评价[J].生态学报,2013,33(24):7 788-7 797.[12] 谭宏伟,杨尚东,吴俊,等.红壤区桉树人工林与不同林分土壤微生物活性及细菌多样性的比较[J].土壤学报,2014,51(3):575-584.[13] 王劲松,吕成群,覃林海,等.两个桉树无性系接种固氮菌造林试验效果初探[J].中南林业科技大学学报(自然科学版),2010,30(12):50-55.[14] 潘虹,曹翠玲,林雁冰,等.石灰性土壤解磷细菌的鉴定及其对土壤无机磷形态的影响[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2015,43(10):114-122.[15] 朱培淼,杨兴明,徐阳春,等.高效溶磷细菌的筛选及其对玉米苗期生长的促进作用[J].应用生态学报,2007,18(1):107-112.[16] 刘聪,林维,孙珑,等.黑土区林地土壤高效解磷细菌的分离、筛选及其解磷效果[J].东北林业大学学报,2013,41(11):83-85.[17] 于翠,吕德国,秦嗣军,等.甜樱桃砧木根际和非根际解磷细菌研究初报[J].沈阳农业大学学报,2006,37(5):769-771.[18] 臧威,孙剑秋,王鹏,等.东北地区四种农作物根际磷细菌的分布[J].中国生态农业学报,2009,17(6):1 206-1 210.[19] 叶震,陈秀蓉,杨淑君.东祁连山高寒植被土壤解磷菌筛选及其解磷能力的初步研究[J].草原与草坪,2010 30(5):6-10.[20] 白文娟,胡蓉蓉,章家恩,等.玉米根际溶磷细菌的分离、筛选及溶磷能力研究[J].华南农业大学学报,2013,34(2):167-176.[21] 黄鹏飞,刘君昂,靳爱仙,等.马尾松根际土壤溶磷菌分离筛选、鉴定及其溶磷效果研究[J].中国农学通报,2012,28(19):12-16.[22] CHEN Y P, REKHA P D, ARUN A B, et al. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities [J]. Applied Soil Ecology, 2006,34(1):33-41.[23] KUCEY R M N. Phosphate-solubilizing bacteria and fungi in various cultivated andvirgin Alberta soils [J]. Canadian Journal of Soil Science, 1983,63(4):671-678.[24] 柯春亮,陈宇丰,周登博,等.香蕉根际土壤解磷细菌的筛选、鉴定及解磷能力[J].微生物学通报,2015,42(6):1 032-1 042.[25] 覃丽金,王真辉,陈秋波.根际解磷微生物研究进展[J].华南热带农业大学学报,2006,12(2):44-49.[26] 王富民,张彦,吴皓琼,等.解磷固氮菌剂的研制及其对小麦的增产效应[J].生物技术,1994,4(4):15-18.[27] 赵小蓉,孙焱鑫.细菌解磷能力测定方法的研究[J].微生物学通报,2001,28(1):1-4.[28] 陈阳,朱天辉,朴春根,等.解磷芽孢杆菌的筛选及其解磷能力的测定[J].贵州林业科技,2008,36(2):17-24.[29] 李蓉,周德明,吴毅,等.杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究[J].中南林业科技大学学报,2012,32(4):95-99.[30] 乔志伟,洪坚平,谢英荷,等.石灰性土壤拉恩式溶磷细菌的筛选鉴定及溶磷特性[J].应用生态学报,2013,24(8):2 294-2 300.[31] 贺梦醒,高毅,胡正雪,等.解磷菌株B25的筛选、鉴定及其解磷能力[J].应用生态学报,2012,23(1):235-239.。
一株高效解磷菌的分离及理化特性研究
一株高效解磷菌的分离及理化特性研究张敏敏;李玉玺;张丽艳【摘要】利用透明圈法和钼锑抗比色法测定发酵液的可溶性磷含量的方法,从滨州沾化冬枣根际土壤中分离出一株高效解磷菌ZMM-3,对该菌株的生理、生化性质及最佳培养条件进行了研究.结果表明,该菌株菌落圆形,革兰氏染色呈阴性,杆菌,大多数理化性质呈阳性,培养最适pH值为7,最佳培养时间为16 h.【期刊名称】《实验科学与技术》【年(卷),期】2014(012)004【总页数】4页(P10-12,34)【关键词】解磷菌;分离;理化性质;培养条件【作者】张敏敏;李玉玺;张丽艳【作者单位】滨州学院生命科学系,山东滨州256603;滨州学院生命科学系,山东滨州256603;滨州学院生命科学系,山东滨州256603【正文语种】中文【中图分类】Q93-331磷是植物生长必需的营养元素之一，它既是植物体内许多重要有机化合物的组分，又以多种方式参与植物体内各种代谢过程，在人类赖以生存的土壤－植物－动物生态系统中起着不可替代的作用［1］。
土壤平均含磷量是0.05 (W/W)，但只有0.1 能被植物吸收，我国有74 的耕地土壤缺磷，土壤中95 的磷为无效形式，土壤有效磷的缺乏是限制植物生长的主要因素之一。
为了获得高产，人们每年都向土壤反复施加大量可溶性磷肥，由于作物对施入的磷肥当季利用效率只有5 ～10，大部分与土壤中的金属离子结合形成难溶性磷酸盐。
土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物，能够将难溶性的磷酸盐如磷矿粉转化为水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，从而改善植物磷素营养，提高作物产量［2－3］。
本文以沾化冬枣为研究对象，从其根围土壤中分离筛选具有较强解磷能力的细菌ZMM－3，对其菌落菌株形态、理化性质、最佳培养条件等进行研究，为以后微生物解磷、提高土壤中水溶性磷和制备菌肥提供理论基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源本实验所用土壤样品取自滨州市沾化县下洼镇大王村冬枣园枣树根系周围。
盐碱地中解磷菌的分离鉴定及其解磷能力研究
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ — — ｓ ｏ ｌ ｕ ｂ ｉ ｌ ｉ ｚ ｉ ｎ ｇ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｆ ｒ Ｏ ｍ ｓ ａ ｌ ｉ ｎ ｅ — ａ ｌ ｋ ａ ｌ ｉ ｓ ｏ ｉ ｌ ／ Ｌ Ｕ Ｈ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ ’ ， Ｗ Ａ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｓ ｈ ｕ ’ ， ＷＡ Ｎ Ｇ Ｈ ｏ ｕ ｗ ｅ ｉ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｏ Ｘ ｉ ａ ｏ ｓ ｈ ｕ ’ （ １ ．
Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｅｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｓｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，
生化 性质、不 同盐碱 条件 下的解磷能 力以及 菌株的 系统发育位置。结果表 明，茵株 Ｓ Ｋ Ｄ Ｊ Ｐ 一 １ 为革 兰氏阴性 ，能 以 柠檬酸、麦 芽糖为碳源生长 ，不能利用葡萄糖 ，接 触酶 以及 氧化 酶均为阳性反应 。在 ｐ Ｈ为８ 且Ｎ ａ Ｃ １ 浓度 为３ ％时 解磷 能 力最大 ，为 ０ ． １ ７ｍ ｇ ・ Ｌ ～ ・ ｄ ～ 。基 于菌株 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序列的 系统发 育树表 明 ，茵株 Ｓ Ｋ Ｄ Ｊ Ｐ 一 １ 属于 芽孢杆菌属 ，
Ｑｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ ２ ６ ６ ５ ９ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；２ ．Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｙ ｔ ｏ ｆ Ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ
景德镇高岭上巾解磷菌的分离及全基因组测序分析
景德镇高岭上巾解磷菌的分离及全基因组测序分析作者：司春灿林英于雅汇龚文轩李优银黄书琪来源：《南方农业学报》2024年第03期摘要：[目的]从景德镇高岭土中分离解磷菌并进行全基因组测序分析，以期为解磷微生物的挖掘及探究其解磷性状和解磷机制提供研究基础。
[方法]对景德镇高岭土中的解磷菌进行分离，采用溶磷指数对菌株分解无机磷和有机磷能力进行初步评估，采用钼锑抗比色法对菌株的解磷能力进行定量分析，采用碱性磷酸酶（AKP/ALP）检测试剂盒对菌株碱性磷酸酶活性进行测定，采用16S rDNA对菌株进行鉴定，选取解磷能力较强的菌株进行全基因测序，并对其解磷相关基因进行分析。
[结果]从景德镇高岭土中分离到5株既能分解有机磷又能分解无机磷的解磷细菌，分别命名为GP1、GP2、GP3、GP4和GP5。
5株菌株均能产生碱性磷酸酶，其中，GP1分解无机磷能力最强，其发酵液中可溶性磷含量最高（61.77 mg/L）;GP4分解有机磷能力最强，其发酵液中可溶性磷含量最高（30.22 mg/L）。
16S rDNA测序结果显示，GP1和GP3为伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia），GP2为副伯克霍尔德属（Paraburkholderia），GP4和GP5为藤黄色杆菌属（Luteibacter）。
管家基因鉴定结果表明GP1为吡咯菌素伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。
基因注释结果显示，菌株GP1含有8个无机磷分解相关基因（pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gdh、gltA、ppa）、4个有机磷分解基因（phoA、phnA、phnW.phnY）、8个磷化合物转运基因（ugpB、ugpA、ugpE、ugpC、pstB、pstA、pstC、pstS）及2个磷缺乏响应双组分调节基因（phoR、phoB）。
[结论]景德镇高岭土中存在解磷细菌，从中分离的解磷细菌具有良好的分解有机磷和无机磷能力，是潜在的良好微生物肥料开发资源。
耐盐碱解磷菌的分离鉴定及解磷能力研究
8.5 58.4
6.05 5.34
61.2
5.30 0.50
9
48.4
6.07 3.21
53.0
6.12 0.32
10
42.6
6.25 1.42
42.3
6.50 0.12
由表 2 结果可以看出，NaCl 含量 变为 2.5%时， C111 和 C141 菌数均无明显变化，说明 C111 和 C141 均 有较好耐盐能力。当 NaCl 含量继续增加，C111 菌数和溶 磷量显著减少，NaCl 含量变为 10%时溶磷量检测不到。 C141 在 NaCl 含量为 2.5%时，溶磷量为 47.8mg L-1； NaCl 含量为 10%时，溶磷量为 41.6mg L-1，表现出强耐 盐能力。
解 磷 菌 （phosphate- solubilizing micro- organisms, PSMs）对土壤有效磷的转化和利用有较大影响，它主要 通过酸化、螯合和离子交换等过程将难溶磷变为可溶 磷，利于植物吸收利用；研究结果证实，施加解磷菌能 促进土壤有效磷转化，提高作物产量[10]。土壤中解磷菌 分布广泛，其对难溶磷的转化主要受环境因素影响。松 嫩平原部分地区土壤严重盐碱化，盐含量高达 2%，pH 高达 10.2[11]，这种极端环境可能抑制解磷菌生长，降低 土壤有效磷含量。耐盐碱解磷菌将有助于提高盐碱化 土壤有效磷含量，促进该地区植物生长，有利于盐碱化 土壤治理。本文首次从松嫩平原安达地区盐碱地筛选 出耐盐碱解磷菌 C111 和 C141，并研究培养条件对其 解磷效果的影响。
土壤通报 Chinese Journal of Soil Science
Vol . 40 , No . 3 Jun . , 2009
耐盐碱解磷菌的分离鉴定及解磷能力研究
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解磷菌的分离纯化与鉴定谢冬东（大理学院农学与生物科学学院 2010级生物科学班，云南大理 671003）摘要：解磷菌在土壤中的解磷作用越来越受到农业生产中占据重要地位，本文将对解磷菌的研究现状、解磷机理、研究方法做一个简述，以及采用平板涂布法分析解磷菌对难溶性磷的分解能力进行测定和对菌种进行鉴定的认识。
关键词：解磷菌；解磷作用；解磷机理；分离纯化；鉴定磷是植物生长发育不可缺少的大量营养元素之一,是植物的重要组成成分,同时又以多种方式参与植物体内各种生理生化过程,对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要的作用（1）。
土壤含有丰富的磷素,既有无机态磷,也有有机态磷,一般是以无机态磷为主（2）。
土壤磷素循环是以微生物活动为中心的。
微生物的活动对土壤磷的转化和有效性影响很大。
国内外大量的研究证明土壤中存在许多微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）。
大量研究表明,某些微生物具有很强的解磷功能,通过其分泌物或吸收作用把土壤中无效态磷转化成有效态磷，采用微生物的解磷作用能够将难溶性的磷酸盐转化为水溶性磷,有效地增加土壤活性磷的含量,从而供植物吸收利用。
因此,对解磷微生物的分离纯化,在生产含有解磷功能的微生物有机肥料对解决植物磷素供应问题是一条很好的途径（3) 。
1 解磷菌的研究现状不同的微生物解磷能力有较大的差异。
尹瑞龄从土壤中分离出了265 株细菌并测定其分解摩洛哥磷矿粉的能力,发现经过6d的培养,溶磷能力平均为2～30 mg/g ,其中株巨大芽孢杆菌、节杆菌、黄杆菌、欧文氏菌及假单胞菌的解磷能力较强为25～30 mg/ g。
Sundara利用Ca3(PO4)2作为磷源,经过14 d 的摇瓶培养,发现几株芽孢杆菌释放的可溶性磷为70. 52～56. 80μg/mL ,埃希氏菌属释放的可溶性磷为159. 70～170. 30μg/mL 。
sundana Rao[测定从豆科植物根际分离出来的几株芽孢杆菌属溶解Ca3 (PO4)2的效率高达19 % ,其中解磷能力最强的是巨大芽孢杆菌(B .megaterium) ,最弱的为短芽孢杆菌( B . brevis) 。
Molla andChowdhury的研究也表明不同菌株分解Ca3(PO4)2的能力有很大的差异。
林启美等（4）发现以磷矿粉为惟一的磷源培养解磷菌,解磷能力较强的菌株为假单胞菌属和欧文氏菌属,并发现真菌的解磷能力比细菌强。
溶磷真菌在数量和种类上都少于溶磷细菌,但溶磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌。
目前研究报道的溶磷真菌多为曲霉属和青霉属。
其中黑曲霉是一种溶磷效果非常好的菌株。
Cerezine 和Nahas等报道了液体培养过程中,随着黑曲霉菌丝体的生长,对不溶性磷酸盐的溶解能力增加。
Vassilev等也研究了黑曲霉对矿物磷酸盐的溶解,其溶解能力最高达292 pg PmL/ L 。
Illmer等也报道了黑曲霉等4 种真菌都能有效地溶解难溶性磷酸铝（3）。
汤树德等(5)对霉菌AN2-7的解磷能力进行了研究,其与国内同类型菌株比较,具有产酸率和溶磷效率高的优良特性。
范丙全等(6）筛选得到2株具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8 和Pn1。
不同培养条件下测定了它们的溶磷能力,并与拜莱青霉菌ATCC20851和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14581进行了比较。
在固体培养基上草酸青霉菌P8 、Pn1 表现较强的溶解Ca3(PO4)2、Ca8[H2(PO4)]6·5H2O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力。
范丙全等（7）在盆栽条件下,研究了溶磷青霉菌P8 对吸收土壤磷素和作物生长的影响。
结果表明,接种青霉菌P8菌剂的土壤都能提高作物的吸磷量,其生物产量比不接种显著提高,且在有效磷低的土壤上其增产幅度大于有效磷高的土壤;刘长霞等（8）从海滨盐碱土筛选出4 种耐盐无机解磷真菌( FM) ,在不同NaCl浓度发酵培养中表现出较强的解磷能力。
王富民等（9）从土壤中筛选出高效溶磷真菌AP2-2 ,能使土壤速效磷含量增加141. 94 %。
以上的研究表明真菌的解磷能力强于细菌。
2 解磷菌的作用及机理2.1 无机磷酸盐的溶解作用(1) 微生物在代谢过程中分泌有机酸, 如乳酸、羟基乙酸、草酸和柠檬酸等。
其中草酸和柠檬酸的活化能力很强。
其活化机理是通过制质子酸化、络合溶解等作用促进磷的释放。
(2) 微生物通过呼吸过程放出的CO2可降低周围的pH值, 从而引起磷酸盐的溶解。
(3) 某些细菌能释放H2S, 它可与磷酸铁作用产生磷酸亚铁和可溶性正磷酸盐离子。
(4) 微生物降解植物残体产生“胡敏酸”和“富里酸”, 它们能与复合磷酸盐中的钙、铁或铝螯合, 释放正磷酸盐。
它们也能与铁或铝的磷酸盐形成稳定的可溶性复合物, 这些复合物可以被植物利用。
2.2 有机磷酸盐的矿化作用微生物对有机物的矿化作用主要是微生物在代谢过程中产生各种酶类, 如核酸酶、植酸酶等使有机磷酸盐矿化, 成为植物可以吸收利用的可溶性磷。
2.3 固定作用可溶性磷酸盐进入生长着的微生物细胞内称为固定作用。
当细胞死亡时, 这种暂时被固定的磷酸盐又被释放出来, 可为植物吸收利用。
细菌和放线菌积累的磷(占其干重的1. 5%～2. 5% ) 略高于真菌(0. 5%～ 1% )(10)。
3 土壤中解磷菌的种类土壤是微生物生长的良好场所。
土壤中能解磷的微生物种类比较多,包括细菌、真菌和放线菌等。
目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属( Bacill us) 、欧文氏菌属( Erwinia) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 、土壤杆菌属( A grobacterium) 、沙雷氏菌属( Serratia) 、黄杆菌属( Flavobacteri2um) 、肠细菌属( Enterbacter ) 、微球菌属( Micro2coccus ) 、固氮菌属( A zotobacter ) 、根瘤菌属( B rady rhizobium) 、沙门氏菌属( S almonella) 、色杆菌属( Cl romobacterium ) 、产碱菌属( A lcali2genes) 、节细菌属( A rthrobacter ) 、硫杆菌属( Thiobacill us) 、埃希氏菌属( Escherichia) ;真菌有曲霉属( Aspergill us) 、根霉属( Rhizopus) 、镰刀菌属( Fusarium) 、小菌核菌属( Sclerotium) ;放线菌有链霉菌属( S t reptomyces)(11)。
而解磷菌在土壤中的数量及种类变化，受土壤质地、有机质含量、土壤类型、耕作栽培方式、气候条件等的影响。
3 解磷菌的分离与纯化微生物的解磷能力一般有三种测定方法,一是将解磷菌株在含有难溶性磷酸盐的固体培养基上培养, 测定菌落周围产生的透明圈的大小; 二是进行液体培养, 测定培养液中可溶性磷的含量; 三是进行土壤培养, 测定其有效磷的含量。
这里主要采用第一种。
3.1 材料与方法3.1材料3.1.1土样土样采自大理洱海周边耕地里（以农田为主），采样时除去表层5 cm 表土,取5～15 cm 深土壤,5 点采集,每份样品重约500 g。
标记备用。
3．1.2菌肥肥田生微生物肥料(多种有益微生物固氮菌，根瘤菌，解磷菌，解甲菌复合)，高效冲施宝(含高效活性菌群90株)，垦易活性微生物有机肥，天源生化有机液肥。
3．1．3 培养基①细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)：牛肉膏3．00 g，蛋白胨10．00 g，食盐5．00 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20．00 g；②基本培养基：葡萄糖l0．00 g，酵母膏0．59 g，硫酸镁0．25 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20．00 g。
3．1．4 试剂和器皿0.80％生理盐水，10％氯化钙溶液，10％磷酸二氢钾，0．1 moL／L氢氧化钾溶液，新鲜鸡蛋，消毒棉球，无菌水灭菌吸管，无菌空试管，无菌平板，1O ml注射器，涂布棒，pH试纸，25～28 培养箱，结晶紫染色液，碘液，95％乙醇，番红染色液。
3．2 分离方法配制成培养基后分装于4个三角瓶中，每瓶100 ml，120℃灭菌30 min。
各取菌肥适量，研钵研细，称取1．0 g加入99 rnl盛无菌水的锥形瓶中，振荡15 min，制成1O-2 浓度溶液，然后按1O倍稀释法进行处理，同样制得10-3、10-4、10-5。
浓度菌悬液。
取10-3、10-4、1O-5浓度菌悬液各0．1 ml均匀涂布于相应冷却好的平板上，每个浓度重复3次。
倒置平板，25～28℃培养箱中培养36—48 h。
3．3 纯化方法在分离平板上选择分离效果较好，已纯化的菌落进行划曲线接种，贴好标签。
已接种好的试管置于30℃培养箱中培养3～5 d，观察是否为纯种，记录特征，置于-4℃冰箱中保藏，有待进一步验证。
3．4 无机磷细菌及有机磷细菌菌株的平板筛选制备磷酸钙盐培养基300 ml，倒平板。
采用三点接种法接到平板上，28℃培养箱中培养5～7 d，根据平板上菌落周围溶磷圈的大小，筛选出解磷能力较强的菌株，保藏相应的菌株。
3．5 磷细菌菌落特征的观察制备牛肉膏蛋白胨培养基100 ml，倒平板后划线，分离出单菌落。
28℃培养，分别于24、48、72 h观察单菌落特征，注意其形状、大小、颜色、光泽、透明度、表面状况、边缘特征、隆起程度、色素等，并作记录。
3．6 革兰氏染色①涂片一自然干燥一固定一染色；②镜检在油镜下观察，菌体呈蓝紫色的为G+，呈红色的为G-，进行结果统计分析（1,12）。
3.7生理生化鉴定3.7.1 糖发酵与氧化实验葡萄糖发酵实验：未隔绝空气的试管中看是否有气泡产生，观察培养基颜色变化。
隔绝空气再观察。
乳糖发酵实验：隔绝空气和未隔气的培养基看是否产酸产气。
3.7.2过氧化氢酶实验将一滴3%的过氧化氢溶液滴于涂在干净载玻片上的菌苔上，观察是否有气泡产生，有气泡产生，则为过氧化氢酶阳性。
4 菌株的鉴定按《伯杰氏分类鉴定手册第九版》鉴定5 小结本文主要对解磷菌的种类了解、解磷机理和试验方法进行综述，并采用了平板涂布法对分解难溶性磷的菌类进行活力测定和鉴定，其结果对以后的解磷菌的研究和合理施肥提供一定的参考。
但很多方面还是会影响到结果的可靠性：（1）采样时间的不同，一年内四季的天气、温度的变化都会对土壤中微生物的种类数量等产生很大的影响。
（2）采集时的土壤条件，是否近水或者当天的土壤的湿度等也会对微生物的数量和活性产生很大影响。
（3）微生物之间有可能存在很大的共生关系，而把他分离培养就忽略其他微生物的作用。