小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析
刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华
【摘要】[Objective] To establish an effective way for isolation and expansion of mouse adipose-derived stromal cells (ADSC), and to observe the biological characteristics of mouse ADSC. [Methods] ADSC were obtained from adipose of BALB/C mouse, isolated and purified in vitro to determine cell morphology, immunophenotype, differentiation potentiality, clone formation ability, growth kinetics and immunoloregulation characteristics in the lymphocyte proliferation inhibition test; T lymphocytes (1 ?105) were cultured in the presence of ConA (ConA was 20 μg/mL), and ADSC of different number interacted with activated T lymphocytes respectively. Experiment was divided into 8 groups by the different number of ADSC: A group as positive control (ConA+T lymphocytes), B group (ADSC 1× 103+ConA+T lymphocytes), C group (ADSC× 1 04+ConA+T lymphocytes), D group (ADSC 2 × 104+ConA+T lymphocytes), E group as negative control (T lymphocytes), F group (ADSC1 ×103), G group (ADSC1 × 104), H group (ADSC 2 × 104), F, G, H were reference groups. The ability of T lymphocyte proliferation was measured by cck-8 method. [Results] ADSC showed plastic-adherent, fibroblastic-like morphologic characteristics, cell proliferation was inadequate and cell morphology changed to flat, enlarged shapes with the passage increasing. ADSC at passage 3 highly expressed CD29 and CD44, moderately expressed Sca-1, weakly expressed CD34, CD45, and CDllb.
Three passaged ADSC could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and had strong ability to shape colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs). Doubling time of three,five, and eight passaged ADSC was (22 ?3)h, (24 ?3)h, and (30 ?3)h, respectively. The proliferation rate after passage 5 slowed down gradually. ADSC could suppress T lymphocyte proliferation, the inhibition ratios of B, C, and D group were 20. 78%, 47. 94%, and 60.70%, respectively, which was similar to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC). [Conclusion] ADSC can be isolated and expanded effectively by using adherent culture, they possess general characteristics of mesenchymal stem cells, in addition, they are easier to be purified and their proliferation rate is faster compared with BMSC,so ADSC may be a good multipotential cell candidate for the future cell replacement therapy.%[目的]建立一种有效的分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的方法,从而为小鼠间充质干细胞(MSC)的来源提供更广阔的选择,以利于MSC在小鼠模型中的研究.[方法]体外分离、纯化BALB/C小鼠ADSC,进行细胞形态、表面标志、成脂及成骨分化潜能鉴定、克隆形成能力、生长动力学等方面的研究,并通过淋巴细胞增殖抑制试验研究其免疫调节特性:用终浓度为20μg/mL的ConA作用于T淋巴细胞(1×105个),以不同数量的ADSC分别与活化T淋巴细胞
作用,根据ADSC数量不同实验分为A组(ConA+T细胞)、B组(ADSC 1×103/孔
+ConA+T细胞)、C组(ADSC 1×104/孔+ConA+T细胞)、D组(ADSC 2×104/
孔+ConA+T细胞),同时E组(单纯T细胞)作为阴性对照组,F组(ADSC 1×103孔)、G组(ADSC 1×104/孔 )、H组(ADSC 2×104/孔)作为参照组.用CCK-8法检测作
用前后T细胞功能.[结果]ADSC镜下形态呈贴壁、梭型,且随着代数的增加,细胞逐
渐增大；第3代ADSC高表达CD29和CD44,中表达Sca-1,低表达或不表达
CD34、CD45、CD1 1b;第3代ADSC可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;第3代ADSC有很强的集落形成能力；第3代ADSC倍增时间为(22±3)h,第5代ADSC 倍增时间为(24±3)h,第8代ADSC倍增时间为(30±3)h,第5代后的ADSC增殖速度随着代数的增加逐渐减慢;ADSC可以抑制T淋巴细胞的增殖,B、C、D组的抑制率分别为20.78％、47.94％、60.70％,抑制能力和骨髓间充质于细胞(BMSC)相似.[结论]通过贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离培养出高纯度ADSC,该方法效率高,培养出的ADSC具有BMSC的一般特性,且与BMSC相比更易纯化,具有更快的增殖速度,有望作为小鼠MSC的有效来源.
【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》
【年(卷),期】2012(033)003
【总页数】6页(P299-304)
【关键词】间充质干细胞;小鼠;骨髓;脂肪组织;免疫调节
【作者】刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华
【作者单位】中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120
【正文语种】中文
【中图分类】R725.5;R329.4
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最初是在骨髓中分离出来的，但后来在脂肪组织、肌肉组织、牙根、胎盘、羊水及脐带血中均分离出MSC
［1］。

MSC 具有促进组织修复［2］、免疫调节［3］和造血支持［4］的作用，故其在临床上有广泛的应用前景。

小鼠是研究造血和免疫的有效动物模型。

目前骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）一直是小
鼠MSC最主要的来源，但由于小鼠骨髓中MSC含量很少（约106个骨髓单个核细胞中含2～5个MSC），而且MSC大多靠近骨髓腔密质骨的表面［5］，故而
用标准的冲出骨髓进行贴壁法培养很难获得足够多的较纯的MSC，大大阻碍了MSC在小鼠模型中的研究。

脂肪组织已经被证明是一种重要的MSC来源，这种MSC称为脂肪来源的间充质干细胞（adiposederived stromal cells，ADSC）。

对人类脂肪间充质干细胞的研究表明，与其他组织相比，脂肪组织中含有大量的MSC，易于在体外培养扩增［6］。

但ADSC在小鼠脂肪中的含量如何，是否易
于纯化和扩增，其生物学特性如何，目前文献报道不多，本文就小鼠ADSC的基
本生物学特性及其免疫调节功能进行研究。

1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂
健康 6～8周龄 SPF级 BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠均为雌性（中山大学实验动
物中心）；DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基（Gibco公司）；标准胎牛血清（Bioind 公司）；2.5 g/L 胰蛋白酶（Bioind 公司）；I型胶原酶（Gibco 公司）；抗小鼠单克隆抗体：Anti-CD11b-FITC、Anti-Scal-1-FITC、Anti-
CD34-FITC、Anti-CD29-PE、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-PE（eBioscience公司）；成脂诱导液及成骨诱导液（广州威佳公司）；cck-8（dojindo公司）；刀
豆蛋白 A（ConA）（sigma公司）。

1.2 ADSC的分离培养及形态学观察
取6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠5只，脱脊处死后750 mL/L乙醇消毒8 min，钝性分离腹股沟内侧皮下脂肪组织，用PBS清洗2遍以除去上面的毛发。

剪碎成1 mm2/小块，4倍体积的1 g/L I型胶原酶37℃下消化50 min（37℃摇箱中，200 r/mim）。

1 000 r /min（r＝ 16 cm）离心 5 min，弃去上层的脂肪及上清，再加入5 mL含100 mL/L胎牛血清、10 g/L青链双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，1000 r/min（r＝ 16 cm）离心 5 min，弃上清后再加入 PBS 重
悬清洗，1000 r/min（r＝ 16 cm）离心5 min，弃上清加入DMEM/F12培养基重悬，200目筛网过滤形成单细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶中，调整细胞浓
度为1 × 105/cm2，置37 ℃、体积分数为50 mL/L的CO2培养箱培养。

24 h
后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3 d全量换液，当细胞达到90%融合时传代，吸出培养基，以 2.5 g/L胰酶消化约1 min，1∶3传代扩增培养，第3代以后按1∶2传代，显微镜下观察不同代数细胞的形态。

1.3 ADSC的细胞表型检测
取融合达90%的第3代 ADSC，以2.5 g/L的胰酶消化细胞成单细胞悬液，以PBS液洗涤3遍，血细胞计数板计数，调整细胞浓度至1×106/mL，分别加入荧
光标记的抗体（Anti-CD11b-FITC、Anti-Scal-1-FITC、Anti-CD34-FITC、Anti-CD29-PE、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-PE），于室温、避光放置 30 min，PBS 液洗去未标记抗体，10 g/L多聚甲醛溶液固定，应用流式细胞仪分析样本中细胞
相应标记抗原的阳性表达率，同型IgG作为相应的阴性对照。

1.4 ADSC 的诱导分化
取第3代细胞，接种于12孔板，调整密度为5× 104/mL，每孔 1.5 mL。

设 3
个复孔及对照组。

①成骨诱导：第3代ADSC接近80%融合时置于含体积分数100 mL/L胎牛血清的成骨细胞诱导培养液培养，每3天换液。

2周后以PBS冲洗3遍，40 g/L多聚甲醛溶液室温下固定20 min，茜素红室温染色5～10 min，弃染色液后蒸馏水洗5次，每次5 min，再用PBS洗15 min，显微镜下观察、拍照。

②成脂诱导：第3代ADSC接近融合时置于含100 mL/L胎牛血清的成脂细胞诱
导培养液A（诱导液）培养，第3天换B（维持液）液，次日再换A液，3 d后换B液，如此循环。

1～2周后，PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛溶液室温下固定20 min，油红O溶液室温染色5 min，弃染色液后PBS洗3次，显微镜下观察、拍照。

1.5 ADSC的克隆形成试验
将第3代ADSC消化后，接种在10 cm培养皿中，每皿1000个细胞，共设3个复皿。

培养10 d，其间予正常换液。

至第10天时，吸弃培养基，PBS洗涤2次后，40 g/L多聚甲醛溶液室温固定20 min，PBS洗涤后加入5mL龙胆紫染液染
5 min，再用PBS洗涤至背景干净，计数直径≥2mm蓝染圆点数目。

1.6 ADSC的的生长曲线绘制
取P3、5、8生长状态良好的细胞，以5×102个细胞 /孔（100 μL，5 × 103/mL）接种于 96 孔板中，置37℃、50 mL/L CO2恒温箱中孵育。

24 h后每孔加入10 μL CCK8，37℃避光孵育3 h后，酶联免疫测定仪测定波长450 nm处的吸光度，取6个复孔吸光度的均值，连续测定一个星期，以时间（t）为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标，绘制生长曲线。

倍增时间公式：tD＝t×lg 2/（lgAt-lgA0），tD 为细胞倍增时间，t为培养时间，At为培养t时间后A值，A0为接种时A值。

1.7 ADSC对淋巴细胞增殖的影响
①脾细胞的制备：6～8周龄 SPF级雌性C57BL/6小鼠1只脱脊处死，750 mL/L 酒精浸泡8 min，无菌取出脾脏，研磨过尼龙网，用10 mL含100 mL/L胎牛血
清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，1 000 r /min（r＝ 16 cm）离心 5 min。

经红细胞裂解液裂解红细胞5 min后再离心5 min，弃上清，培养液重悬，以苔
盼蓝染色计数活细胞数，调整密度至1×106/mL。

②CCK8法检测淋巴细胞增殖
功能：取P 3～6代的ADSC经消化、计数，不同数量的ADSC分别与1×105个活T细胞反应，分8组：A 组（ConA+T细胞）、B 组（ADSC 1×103/孔
+ConA+T 细胞）、C 组（ADSC 1 × 104/孔+ConA+T 细胞）、D 组（ADSC 2 × 104/孔+ConA+T 细胞），同时E组（单纯T细胞）作为阴性对照组，F组（ADSC 1 × 103/孔）、G 组（ADSC 1 × 104/孔）、H组（ADSC 2×104/孔）则作为参照组，以消除 ADSC扩增引起的A值变化。

ADSC数量：T细胞数量＝1∶100、1∶10、1∶5。

以上各组分别接种于 96 孔板，培养体系为含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640培养液，每组设6个复孔，保证各孔的终体积为200 μL，ConA 的终浓度为20 μg/mL。

培养板置于37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度条
件下培养 72 h，在培养结束前3 h向各孔中加入CCK-8，20 μL/孔，培养结束后，酶联免疫测定仪测定波长450 nm处的吸光度，取6个复孔吸光度的均值，增殖
抑制率r＝（1-A 实验组 /A 阳性组）×100%。

2 结果
2.1 ADSC 形态学观察
24 h后可见少量细胞贴壁，细胞多为单个，形态呈梭形或星形，此时第1次换液，换液后2～3 d可见数个大小不等的克隆，4～6 d后细胞快速增殖，每个集落中的细胞不断增殖融合成片，形态以梭形为主。

第6天可第1次传代，经胰酶消化后
的ADSC呈圆形，胞体较大，传代24 h内完全贴壁伸展，呈成纤维细胞样形态（图1）。

第1代的ADSC 3 d后可第2次传代，传代后的ADSC胞体逐渐增大，第3代以后以不规则星形为主要形态。

2.2 ADSC表面标记检测
ADSC 经流式细胞术检测，CD29、CD34、CD44、CD45、CD11b、Scal-1 表达率分别为 99.64%、3.65%、99.51%、1.89%、0.60%、62.63%（图 2）。

2.3 ADSC 的诱导分化
ADSC经成骨诱导后由于细胞间的挤压，形态变为较规则的三角形或立方形，诱导1周时可见少量钙盐，诱导2周后可见大量钙盐沉积（图3）。

成脂诱导1周后，
细胞形态变得大而不规则，可见大量脂滴聚集（图4）。

2.4 ADSC 隆形成试验
ADSC在10 cm大皿中培养10 d染色后可见很多散在分布的点、片状细胞集落，平均细胞集落（直径≥2 mm）形成率为（16.8 ± 0.23）/1 000。

40倍显微镜下
可见细胞集落中的细胞形态，此时的ADSC因密度低，生长空间大，细胞铺开，
胞体明显增大（图 5）。

2.5 ADSC 生长曲线
由生长曲线可见ADSC在24～36 h进入快速增殖期，约48 h进入对数生长期，第5天之后细胞生长速度减缓，进入平台期。

第3代细胞增殖速度最快，第5代
稍慢，第8代时增殖速度明显下降。

第 3代 ADSC倍增时间为（22±3）h，第 5代ADSC倍增时间为（24±3）h，第8代ADSC倍增时间为（30± 3）h（图 6）。

2.6 ADSC对淋巴细胞增殖的影响
当ADSC与淋巴细胞数量比值分别为1∶100、1∶10、1∶5 时，各实验组（B、C、
D 组）对应的平均 A值—对应参照组（F、G、H组）A值平均值分别为0.385 ±
0.026、0.253 ± 0.010、0.191 ± 0.008，较阳性对照组 A 组（A 值为0.486± 0.017）均有明显下降（P ＜0.05），抑制率分别为20.78%、47.94%、60.70%，且不同数量ADSC组间比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05，图 7）。

3 讨论
小鼠骨髓MSC远比人骨髓MSC难培养，小鼠BMSC按常规的贴壁法培养很难获得理想的结果，这或许可以归结于骨髓中含有大量的造血干细胞以及含量极低的
MSC，另外骨髓中的巨噬细胞、内皮细胞、脂肪细胞等细胞的贴壁生长及长期存活亦可导致BMSC的分离培养相对于其他种属难度更大。

因此，寻找易于纯化和扩增的小鼠MSC，对于MSC在小鼠模型中的研究极其重要。

本实验通过研究小鼠ADSC的培养及功能鉴定，证明了其具有MSC的一般特性，为其取代BMSC 参与相关实验研究提供了理论上的依据。

本研究从形态学、流式检测细胞表型、诱导分化、克隆形成、生长动力学、免疫调节功能测定等方面对ADSC进行鉴定。

ADSC形态上表现为成纤维细胞样，但随着代数的增加逐渐铺开呈不规则星形。

第1次传代时可获细胞数约1×106个，以后每3 d按1∶3传代一次，到第3代可获总细胞数约2×107个，所需时间为2周左右。

而小鼠BMSC采用传统全骨髓贴壁法培养从开始到获得较均一的不含造血干细胞的克隆至少需要2个月的时间［7］。

流式细胞术检测第3代细胞免疫表型，造血干细胞表面标志CD45、CD11b、CD34为阴性，MSC标志CD29、CD44、Scal-1为阳性，与文献报道MSC表型相符［8］，而无论是采用全骨髓贴壁法或者低密度培养法培养的BMSC达到免疫学表型的符合至少要在第10代［7-10］。

在特定培养基的诱导下，ADSC可成脂肪及成骨分化，完成的时间分别为1周和2周，而BMSC用常规方法完成成脂、成骨分化的时间则分别为 1～3周和 3周［7］。

ADSC较BMSC能更快的完成成脂、成骨分化。

从ADSCP3、P5、P8的生长曲线可以看出，P3、P5细胞增殖速度差异不大，保持着相对较快的增殖速度，但P8细胞的增殖速度则明显减慢，说明随着代数的增加ADSC的活性呈下降的趋势，结合形态学方面的改变，推测P8 ADSC已发生老化，这和文献报道BMSC的的活性维持时间有明显的差别，后者可长期传代，最长有大于30代的报道［7］。

但在动物模型研究和临床应用中，一般选用3～5代的细胞，传代次数太多，有染色体畸变的可能，不适合细胞治疗。

克隆形成是干细胞的一大特性，本实验证实ADSC具有形成集落的能力，形成率与文献报道接近，并优于
BMSC［11］。

在淋巴细胞增殖抑制试验中，1×103/孔、1×104/孔和2×104/孔的 ADSC均能
有效抑制ConA介导的T淋巴细胞增殖，且这种抑制作用与ADSC数量呈正相关，当ADSC与淋巴细胞数量比值分别为1∶100、1∶10、1∶5 时，各实验组抑制率分别为20.78%、47.94%、60.70%。

在小鼠 BMSC 介导的同种异体淋巴细胞增
殖抑制试验中，当BMSC与淋巴细胞数量比值分别为1∶50、1∶1时，抑制率分
别为 15.23%、82.12%，抑制率和 BMSC 数量呈正相关［12］。

这说明ADSC
具有和BMSC相似的免疫调节特性，可用于免疫学方面的实验研究。

综上所述，ADSC具有与和BMSC相似的生物学特性和免疫调节功能，但其稳定
性差、生物活性持续时间短、可传代数少的缺点决定了只能选用P3-P5代进行相
关研究，这为其广泛应用带来了不利的一面，是ADSC本身特性如此还是未找到
满足其生长增殖的最佳条件，还需要进一步的实验研究。

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