替尼泊苷长循环阳离子脂质体的制备

替尼泊苷长循环阳离子脂质体的制备
钟琳;楼兴法
【摘要】目的优化薄膜分散法制备替尼泊苷长循环阳离子脂质体的最佳处方.方法薄膜分散法制备脂质体,以粒径和包封率为考察指标,用单因素考察和正交设计等方法优化脂质体的处方.结果优化后的最佳处方为:磷脂DSPC和PEG 5000-DOT-MA比为4:1,药物和磷脂比为1:4,磷脂与胆固醇比为2:1,乳化剂为卵磷脂.优化的脂质体平均粒径为115.45nm,平均Zeta电位为25.54 mV,平均包封率为
91.32%,5±3℃放置180 d和25±2℃放置30 d各项指标变化不显著.结论制备的替尼泊苷长循环阳离子脂质体包封率高,粒径小,释放缓慢,稳定性和安全性
好.%Objective To optimize the formulation of long-circulating cationic teniposide-containing liposomes .Methods The long-cir-culating cationic teniposide-containing liposomes were prepared by thin film dispersion method .Single factor experiment and or-thogonal design were adopted to screen the formulation .Results The ideal combination of formulation was as follows :DSPC-PEG 5000-DOTMA (4:1);teniposide-phospholipid
(1:4);phospholipid-cholesterol (2:1);lecithin as an emulsifier with purity of 80% .The average particle size of the optimized long-circulating cationic teniposide-containing liposomes was 115 .45 nm (n=3) , and the average Zeta potential was 25 .54 mV (n=3) ,and the average encapsulation efficiency was 91 .32% (n=3) .The tenipo-side-containing liposomes were quite stable after being stored in 5 ± 3 ℃ for 180 d and 25 ± 2 ℃ for 30
d .Conclusion Th
e opti-mized ,sustained release long-circulating cationic
teniposide-containing liposomes with satisfied size and high entrapment efficiency were obtained ,which was safe and stable .
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2017(032)006
【总页数】4页(P771-774)
【关键词】替尼泊苷;长循环阳离子脂质体;薄膜分散法;磷脂;卵磷脂;胆固醇
【作者】钟琳;楼兴法
【作者单位】杭州市萧山中医院药剂科,杭州 311200;杭州市萧山中医院药剂科,杭州 311200
【正文语种】中文
【中图分类】R944
替尼泊苷具有较强的广谱抗肿瘤活性，用于治疗白血病、恶性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤等，具有脂溶性大、易透过血脑屏障和毒性低等特点[1]。

但其溶解性极差，生物利用度低，大大限制了其在临床上的应用。

目前上市的有注射液，但其处方中用到的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油致敏性极高；该注射液使用时需要根据不同的治疗周期配制多个不同浓度的稀释溶液，且静脉输注频繁，周期长，配制的稀释静脉输注液还易产生沉淀，存在的这些安全隐患既给医护人员带来心理压力，也给患者带来意外的危险[2]。

长循环脂质体[2-4]可有效减少不良反应，能提高药物的靶向性、生物利用度和治
疗指数。

本文采用薄膜分散法[5-6]，通过考察磷脂种类、不同的磷脂比、乳化剂
种类和投入量、药脂比、磷脂与胆固醇比等因素，筛选出最优处方。

1.1 仪器 RV8旋转蒸发仪(IKA®)；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪(英国马尔文公司)；Optima XPN-100 Uitracentrifuge(美国贝克曼库尔特公司)；德国Dionex-
U3000液相色谱系统(DionexChemeleon色谱工作站，DAD检测器，美国戴安公司)；224-1CN电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；α1900S紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；TGL-16M台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试药替尼泊苷(江苏亚邦药物研发有限公司，批号140719，质量分数98%以上)；二油酰磷脂酰胆碱DOPC,二硬脂酰基卵磷脂DSPC，聚乙二醇5 000-N-[1-(2，3-二油酰氯)丙基]-N，N，N-氯化三甲胺PEG5 000-DOTMA，聚乙二醇5 000-二肉豆蔻甘油丝氨酸PEG5 000-DMGS，卵磷脂(质量分数80%)和胆固醇(均为上海艾韦特医药科技有限公司惠赠)；聚氧乙烯蓖麻油，波洛沙姆
188(GATTEFOSSE公司惠赠)；色谱纯：三氯甲烷、乙醇(天津市富起化工有限公司)；水为纯化水；其余药品、试剂均为分析纯。

2.1 脂质体的制备称取处方量的替尼泊苷、磷脂和胆固醇，用三氯甲烷10 mL溶解，转移至250 mL圆底烧瓶中，在提前准备好的50 ℃的恒温水浴锅中减压蒸去三氯甲烷，得到一层均匀薄膜，加入含有乳化剂的PBS缓冲液(pH值为7.40) 5 mL，恒温水浴锅中振荡水化30 min，形成乳白色溶液，探头超声(功率为30%)，超声10 min(超声10 s停10 s)[7-9]，得到粒径较小的纳米脂质体溶液。

2.2 脂质体包封率的测定文献主要采用HPLC或HPLC-MS/MS等方法测定的替尼泊苷的质量浓度[10-11]，为了实验操作方法的适用性和方便性，本文采用UV 法测定替尼泊苷的质量浓度[12]。

2.2.1 检测波长的选择分别精密量取适量空白脂质体和替尼泊苷各50 mg，分别置于50 mL量瓶中，用氯仿溶解，吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，用乙醇定容
待用。

以乙醇为参比，扫描显示在波长220 nm 处有紫外吸收，空白脂质体无干扰。

2.2.2 标准曲线的建立精密称取替尼泊苷100 mg，加适量氯仿超声溶解并定容至50 mL，作为储备液，精密量取一定量储备液，用甲醇稀释并分别配制质量浓度为1，10，20，50，100和150 μg·mL-1的标准溶液，分别测吸光度值，以吸光度值对质量浓度作图，得标准曲线方程，结果表明，质量浓度在1～150 μg·mL-1
范围内，吸光度值和质量浓度线性关系良好。

2.2.3 精密度精密称取原药50 mg，加适量氯仿超声溶解并定容至50 mL，作为
储备液，精密量取一定量储备液，用乙醇稀释并分别配制成质量浓度为80，100
和120 μg·mL-1的溶液，各质量浓度平行3个样品，各样品测3次。

测得平均质量浓度分别为80.25(RSD值为0.125%，n=9)，100.14(RSD值为0.153%，n=9)和120.04 μg·mL-1(RSD值为0.160%，n=9)。

2.2.4 回收率精密称取原药50 mg，用空白脂质体溶液定容至50 mL，混匀，取
1 mL，3份，用适量氯仿溶解，加乙醇定容至20 mL量瓶中，测吸光度值，平均回收率为96.38%，RSD值为0.52%(n=9)，表明空白脂质体无干扰。

2.2.5 超滤离心法精密称取载药脂质体溶液适量，以15 000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，用少量氯仿溶解离心沉淀物[13-14]，用乙醇定容，测吸光度值，用
标准曲线方程计算药物质量浓度，计算公式为:包封率=(1-M1/M2)×100%(M1为沉淀物游离药物的量，M2为载药脂质体总药物量)。

2.3 体外释放实验将半透膜在水中浸泡过夜，取游离药物的PBS缓冲液或脂质体
溶液各1 mL，分别加入2个透析袋中，两端夹紧，置于100 mL PBS (pH值为7.40) 缓冲液中，37 ℃恒温水浴，转速为50 r·min -1，分别于0，2，4，8，12，24，36，48和72 h取样0.5 mL，及时补充0.5 mL PBS缓冲液，0.2 μm滤膜
过滤样品，测定不同时间段样品的药物含量。

2.4 脂质体粒径和电位测定吸取适量纳米脂质体溶液，用水稀释10倍，加入到检测仪的石英比色皿和毛细管小池中，测定粒径大小、分布及Zeta电位。

2.5 稳定性实验将纳米脂质体溶液分别放置在2～8 ℃冰箱和25±2 ℃恒温箱中，分别于0，3，6个月和0，2，4周取样，观察样品的外观形状并测定平均粒径及分布、Zeta电位、pH值、包封率及渗漏率的变化情况。

2.6 影响脂质体的处方因素考察
2.6.1 磷脂种类的影响考察的磷脂为中性磷脂DOPC、DSPC、阳离子磷脂PEG5 000-DOTMA和阴离子磷脂PEG5 000-DMGS，按照2.1项下方法改变磷脂种类制备脂质体，药物投料为50 mg，胆固醇50 mg，质量分数80%的卵磷脂30 mg(乳化剂)，选取的方案为：①150 mg HSPC；②150 mg DOPC；③120 mg HSPC+30 mg PEG 5 000-DOTMA；④120 mg DOPC+30 mg PEG 5 000-DOTMA；⑤120 mg HSPC+30 mg PEG 5 000-DMGS；⑥120 mg DOPC+30 mg PEG 5 000-DMGS。

6组分别进行实验，将制备好的纳米脂质体溶液放置在25±2 ℃恒温箱中，1周后取样，平均粒径分别为485.41，467.54，128.84，207.80，341.25和327.28 nm；包封率分别为40.56%，45.65%，87.87%，7
3.60%，63.77%和65.21%。

由此可知，由中性磷脂制备出的脂质体样品①和样品②稳定性很差，平均粒径较大，包封率很低，肉眼可见样品底部有大量白色沉淀物，脂质体溶液分层很厉害，由中性磷脂加阴离子磷脂制备的脂质体样品⑤和样品⑥次之，中性磷脂加阳离子磷脂制备的脂质体稳定性较好，其中样品③的脂质体稳定性最好，因此选用中性磷脂[15]HSPC加少量阳离子磷脂PEG5 000-DOTMA 的混合磷脂作为最优磷脂。

2.6.2 乳化剂种类的考察按照2.1项下方法改变乳化剂的种类来制备脂质体，磷脂选用120 mg HSPC和30 mg PEG 5 000-DOTMA，胆固醇50 mg，药物投料量50 mg，乳化剂30 mg，实验方案为：①不加乳化剂；②纯化级聚氧乙烯35
蓖麻油；③质量分数为80%的卵磷脂；④波洛沙姆188。

将制备好的脂质体溶液
放置在25±2 ℃恒温箱中，1周后取样，平均粒径分别为447.98，237.35，140.73和202.16 nm；包封率分别为52.46%，75.15%，88.24%和78.27%；
由此可知，当乳化剂为卵磷脂时，脂质体的稳定性最好，平均粒径变化最小，包封率最高。

因此，乳化剂选择质量分数为80%的卵磷脂。

2.6.3 药物与磷脂比的影响按照2.1项下方法改变药物与磷脂的质量比制备脂质体，磷脂选用120 mg HSPC和30 mg PEG 5 000-DOTMA，胆固醇50 mg，乳化
剂30 mg的质量分数为80%的卵磷脂，按照药脂比为1∶2，1∶3，1∶4和1∶6来计算药物投料量分别为75，50，37.5和25 mg，测定制备出的脂质体平均粒
径和包封率，平均粒径分别为128.42，115.25，120.72和225.62 nm；包封率
分别为80.34%，82.76%，92.43%和78.17%。

由此可见，药物投料越大，粒径
先降后增，包封率先增后降，结合两者结果可知，选取药脂比为1∶4较为合适，即药物投料为37.5 mg结果较好。

2.6.4 磷脂与胆固醇比的影响按照2.1项下方法改变磷脂与胆固醇的质量比制备脂质体，磷脂选用120 mg HSPC和30 mg PEG 5 000-DOTMA，乳化剂为质量分数80%的卵磷脂投料30 mg，药物投料50 mg，选用的磷脂与胆固醇的质量比为8∶1，6∶1，3∶1和2∶1，根据磷脂与胆固醇的质量比来计算胆固醇的投料分别为18.75，25，50和75 mg，测定制备出的脂质体平均粒径和包封率，平均粒径分别为179.63，164.56，140.63和126.37 nm；包封率分别为81.10%，
82.24%，84.71%和90.14%。

由此可见，当磷脂与胆固醇比越大，平均粒径越小，包封率越高，当磷脂与胆固醇比为2∶1时，平均粒径和包封率结果最好，因此选择磷脂与胆固醇比为2∶1。

2.7 正交实验优化处方
2.7.1 影响因素和水平的确定在单因素考察的基础上，确定HSPC与PEG 5 000-
DOTMA的比例(A)，乳化剂的量(B)、药脂质量比(C)、总磷脂与胆固醇比(D)为主
要因素，每个因素选择3个水平，按照正交设计的原理用设计表L9(34)进行实验，因素水平见表1。

2.7.2 正交实验设计与结果以包封率为指标，按照正交设计的原理选用L9(34)设
计表进行实验，考察难溶性药物脂质体的最优处方。

结果见表2。

以包封率作为参考指标时，比较R值可知D>C>A>B，即对脂质体包封率影响大
小的因素顺序为磷脂胆固醇比>药脂比>磷脂比>乳化剂的量，由此可知，通过正
交实验得出的最佳处方为A3B1C2D2，即磷脂比(HSPC∶PEG 5 000-DOTMA)为4∶1，乳化剂的质量为25 mg，药脂比为1∶4，磷脂与胆固醇比为2∶1。

2.8 验证实验从上述单因素考察和正交实验得出最佳处方:HSPC 120 mg，PEG 5 000-DOTMA为30 mg，质量分数80%的卵磷脂的质量为25 mg，药物投料为37.5 mg，胆固醇投料为75 mg，为了考察处方和工艺的稳定性和重复性，按照
最佳处方制备3批脂质体样品，按照2.4项下方法考察脂质体的稳定性。

将脂质体溶液放置在2～8 ℃冰箱中6个月后观察外观呈乳白色淡蓝色乳光的溶液，测定其平均粒径为120.58 nm，平均包封率为90.32%；将脂质体溶液放置在25±2 ℃
恒温箱中4周后观察外观呈乳白色淡蓝色乳光的溶液，测定其平均粒径为123.16 nm，平均包封率为88.73%。

结果表明，该脂质体处方和工艺稳定，重复性好。

2.9 体外释放实验结果准确量取相同药物质量浓度游离药物PBS溶液和长循环阳
离子脂质体溶液各1 mL，按照2.3项下方法进行体外释放实验，分别检测所取样
品的含量，计算累积释放率，结果见图1。

由图1可知，游离药物在12 h释放就达到90%左右，而载药脂质体需要72 h释放才达到90%左右，说明药物通过制备成长循环脂质体后性质稳定，释放缓慢，
达到设计目的。

本实验筛选了4种磷脂种类，包括中性磷脂和带电PEG化磷脂，结果表明，由中
性磷脂制备的脂质体稳定性极差，易析出沉淀，这与脂质体的环境有关，脂质体环境体系不稳定、容易聚集等影响脂质体的稳定性，发生药物泄漏导致包封率低，当加入带电PEG化的磷脂时，脂质体溶液电荷形成排斥作用，不容易聚集，从而形成稳定的溶液体系，其中中性磷脂加阳离子PEG化磷脂的效果最好，制备的长循环阳离子脂质体PEG通过氢键作用，在被修饰的阳离子脂质体表层形成一层水分子膜，掩盖阳离子脂质体表面的正电荷，达到抑制血清蛋白非特异性吸附并减少吞噬系统识别的作用，PEG在阳离子脂质体表面呈部分延伸的构象，形成立体位阻层，将靠近的蛋白质隔离，减弱血清蛋白的吸附作用，延长了复合物在体内的循环时间，提高了脂质体在血循环中的稳定性。

本实验进行了乳化剂种类的筛选，乳化剂影响脂质体溶液的粒径大小和稳定性，可有效提高溶液体系的表面张力，从而提高脂质体的稳定性，使得脂质体水化过程中粒径更均一，本文选用的卵磷脂效果最好，从安全性考虑，卵磷脂也属于最佳乳化剂，根据报道纯度特别高和纯度特别低的卵磷脂不利于脂质体溶液体系的形成和稳定[16]。

因此,本文选用的卵磷脂纯度为80%，属于天然来源的表面活性剂，无毒性、无刺激性、无溶血和变态反应，生物相容性好。

从单因素和正交实验可知，随着药物投料越来越大，包封率先增后降，在药物的包封率达到饱和之前，包封率随着药物投料增加而增大，当包封率达到饱和之后，继续投料，脂质体无法包裹过量的药物，游离药物容易在有机溶剂蒸干时析出，造成脂质体粒径增大，包封率下降；胆固醇在脂质体中可调节膜的柔韧性，增加膜的流动性，结果表明，当胆固醇与磷脂的质量比为1∶2时，脂质体的各项指标最好，当继续增加胆固醇的量时，包封率下降，可能的原因是过量的胆固醇占用了脂质体的空间，使得包裹药物的空间减少。

由最佳处方制备的长循环阳离子脂质体溶液，2～8 ℃放置6个月后平均粒径为120.58 nm，平均包封率为90.32%，平均电位为25.98 mV；放置在25±2 ℃恒
温箱中4周后平均粒径为123.16 nm，平均包封率为89.73%，电位为24.59 mV，包封率符合《中国药典》的要求，粒径和电位结果也表明粒度均一，由此得知该长循环阳离子脂质体处方和工艺稳定，重复性好，稳定性和安全性良好，缓慢释放合理。

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