克拉维酸发酵工艺研究

克拉维酸发酵中试工艺研究1

（之温度控制对溶氧及其效价影响）

摘要:本文在500L 自动控制发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验。分别将发酵过程全程

温度控制在 24℃--26℃下进行发酵时, 通过对发酵各阶段的重要参数的对比分析, 发现温度对棒状链霉

菌的生长和代谢有重要影响, 降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾。进而通过对发酵

过程的变温控制, 使克拉维酸的发酵相对稳定，且产量提高20--70%。

关键词:克拉维酸;发酵;变温控制;溶氧；效价；

克拉维酸( clavulanic acid, CA) 是一种β -内酰胺酶，抑制剂, 本身抗菌活性很弱。但当CA 与β-内酰胺类抗生素制成复方后可以增强β-内酰胺类抗生素的抗菌活性和增大其抗菌谱, 有助于克服β-内酰胺类抗生素耐药性。CA 是由棒状链霉菌( Str ep tomy ces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物。在研究中我们发现CA 发酵在进入对数生长期后溶氧易于跌零, 影响 CA 生物合成。据文献报道温度对棒状链霉菌生长和CA 合成对CA 发酵的影响并研究如何通过变温控制提高CA的发酵水平。

1.材料和方法

1.1菌种实验室正常筛选菌种（出处保密，编号为BS-1）

1.2试剂

硫酸氢四丁基胺、NaH2PO4 ·2H 2O、乙腈( 色谱级) 、NaOH、Ac标准品。

1.3培养基

（1）种子培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精;

pH 8. 0, 121℃灭菌20min。

（2）一级种子培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、酵母粉、豆油、碳酸钙、硫酸镁、消沫剂。

（3）二级种子培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、豆油、氯化锌、氯化铁、氯化锰、氯化铜、消沫剂。

（4）发酵罐培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化铁、氯化镁、氯化锌、氯化钙、豆油、消沫剂。

1. 4 培养

（1）种子培养在无菌的条件下, 向装量为

600ml/ 3000m l三角瓶中接入3. 5ml 孢子液。在25℃,

180r/ min 条件下摇床培养 67h,

（2）一级种子罐培养摇瓶菌丝转入6.5L/10L一级种子罐，接种量为15ml.培养18h。

（3）二级种子罐培养在无菌条件下,从一级种子转65L/150L 二级种子罐，接种量为6.5L，培养16h。

（4）发酵培养在无菌条件下, 从二级种子罐转入300L/500L 发酵罐中进行培养，转后365L。采取分批补料工艺, 从16h 左

右开始补加甘油, 用20% 氨水自动调控pH 在7. 0±0. 05 范

围之内。以溶氧15% 作为最低限制性溶氧值, 每间隔6h 取样

进行离线参数测量, 包括pH 、菌浓、黏度等参数并涂片观察

菌丝状态;从25h以后开始进行效价测量。当大比例的菌丝开

始自溶、效价停滞时放罐。

1. 5 测定方法

（1）菌体浓度的测定采用菌丝占溶液体积的百分比表示。取10ml 发酵液反复的离心( 3500r/ min, 10m in) 和洗涤, 直

到离心后的固含物中不含有杂质为止, 记下菌丝的体积百分

比作为菌体浓度; 发酵液第一次离心得到的上清液留用。

（2）克拉维酸测定采用高效液相色谱法

色谱柱SB-C18 ( 4. 6m m×100m m, 3. 5 m) ；流速1.5ml/ min,温度 33℃, 注射量 20ul ；检测波长 210；压力 60--100bar；

流动相为10mm ol/ L 硫酸氢四丁基胺∶甲醇( 100 ∶ 15, V / V ) , pH2, 硫酸氢四丁基胺需要用0. 45 m 有机膜过滤。

样品处理精确称取发酵液离心所得的上清液0. 5±0.

05g , 置 100m l 的容量瓶中, 用 pH5. 4 含乙腈 6% 的20m mol/ L 的NaH2PO4 溶液定容。用2 ml的微量进样器进样。

2温度控制对CA发酵影响方案设计及其结果分析

2.1CA 发酵进行温度培养试验, 其空气流量、搅拌转速均、补水等工艺相同。试验方案分为：

a发酵开始培养温度为26℃，溶氧低于30% 时降温一次,一次降温0.5℃，最低温度24℃；溶氧反弹至35%以上开始升温最高26℃。

b发酵开始培养温度为26℃，按照时间降温，发酵20h开始降温，降温速率为0.5℃/0.5h，最低温度24℃；溶氧反弹至35%以上开始升温最高26℃。

以上两个方案作为对比，进行中试发酵试验。

2.2实验数据

2.2.1 a和b方案对溶氧的影响分析

采用a方案，本批根据溶氧控制降温，在发酵28h开始降温，溶氧容易长时间低至15%以下；采用b方案，定时20h开始降温，能够在前期延缓对数生长期，有效避开溶氧低谷，溶氧不会低于15%。

2.2.2 溶氧对效价的影响分析

a方案在整个发酵控制过程中，出现长时间溶氧低于15%，导

致发酵产物CA增长幅度较慢，发酵终点效价较低。

A方案放罐效价为4371u；b方案放罐效价为7235u；b方案较

a方案产量高出65.6%。

2.2.3以上两个方案经过多次验证，结果一至。

2.3结论

在CA 发酵过程中可以通过变温控制的方式及其变温时间的调整，对菌体的生长和生产进行控制。从而达到生产稳定，提高产量的目的。