冷冻切片方法及注意事项

一、实验前准备

清理实验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。

准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材

解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。

（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。）

三、冷冻切片

1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。）

②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

③冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎裂,出现梯田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够,切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。

④当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的

载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色

染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。

2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。

3、0.5%盐酸乙醇分色1~2秒。蒸馏水快洗。

4、0.25%~0.5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。

5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。

6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。

7、100%乙醇2次，每次1~2分钟。

8、二甲苯2次，每次1~2分钟。中性树胶封固。

注：①结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。

②HE染色的水洗：整个染色过程中共5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。

苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色），导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。

苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。

分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（0.5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。

蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。

五、冰冻切片的快速染色法

①切片固定30秒－1分钟。

②水洗(10秒)。

③染苏木素3－5分钟。自来水冲洗片刻。（在组织上加苏木精染液数滴,放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干）

④分化(1%酸乙醇分化)。

⑤于碱水(氨水)中返蓝20秒。

⑥伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

注：固定液的选择

A中性福尔马林溶液B95%乙醇

C AF(40%福尔马林10ml,95%乙醇90ml)

D Carnoy(纯乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)

E Clzrke改良液[4](纯乙醇95ml,冰醋酸5ml)

F Bouin液(饱和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液25ml,冰醋酸5ml)

6种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异,其中 C 固定液固定的切片染色效果最好,组织结构清晰,核染色鲜艳,核无明显肿胀,核浆对比度好,镜下与石蜡切片相似(图1)。D 液、E 液、F 液染色效果均较好,结构较清晰,核染色较鲜艳,但核有肿胀,核轮廓有些模糊。A 液染色效果较差,组织结构尚清楚,但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清(图2)。B 液染色效果差,核着色不良,结构模糊。

甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸对组织均有固定作用。甲醛对组织的穿透力强,对组织无明显收缩和膨胀作用,但它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以甲醛固定的组织结构尚完好,核有肿胀、模糊。乙醇对组织有脱水收缩作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所产生沉淀可溶解于水,使核着色不良。冰醋酸对组织有明显的膨胀作用,加重了冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以用含有冰醋酸的混合固定液(如 D 液、E 液、F 液)固定的组织,核肿胀明显。F 液中虽然苦味酸对组织有明显的收缩作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了细胞的肿胀。本实验提示混合固定液对冷冻切片HE 染色的效果优于单纯固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推荐冷冻切片做HE 染色时首选AF 固定液。同时,其具有配制简单、使用方便的优点。

六、实验后打扫

冷冻切片机使用结束后关闭电源,清洁腔体和擦干水气, 做好使用记录。为让水蒸气蒸发，请不要马上关闭切片机的上盖移门，待过段时间再关。

如需详细说明，请借阅说明书。

七、主要试剂与溶液的配制

1、10%甲醛

甲醛水溶液（30~40%）100mL，蒸馏水900mL。

价格便宜，对标本浸透快，不会产生过硬效果，可作为大标本的保存液，每隔3个月更换新液体，但可产生甲醛色素颗粒。