基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因检测的诊断价值
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【关 键 词 】 基 因 芯 片 ； 分 枝 杆 菌 ； 鉴 定 ； 耐 药 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－９４５５．２０１４．１２．００２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－９４５５（２０１４）１２－１５９５－０４
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ＊ ＺＨＡＯ Ｌｉａｎ－ ｓｈｕａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎ，ＤＡＩ Ｄｉ，ＣＨＥＮ Ｘｉｎ，ＹＵＮ Ｋｅ，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎ△ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ ｌｉａｏｎｉｎｇ，１１０００１，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｕｔｕｍ，ｕｒｉｎｅ，ｐｌｅｕ－ ｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ，ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃ－ ｔｅｒｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｒｉ－ ｆａｍｐｉｎ ａｎｄ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ ｆｕｒｔｈｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｍｏｎｇ ９１ｓａｍｐｌｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，１６ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ， ２ｃａｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（１ｃａｓｅ ｏｆ Ｇｏｒｄｏｎ′ｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ，１ｃａｓｅ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ），ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓ １９．８％ （１８／９１），ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ １７．６％ （１６／９１）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｎ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ２．２％ （２／９１）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆ－ ｆｅｒｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｐｕｓ，ｓｐｕｔｕｍ，ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ３３．３％ ，２４％ ， １８．８％，１６．７％ ａｎｄ １５．８％．５７ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅａｒ ａｃｉｄ－ｆａｓｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ｃｈｉｐ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ １６ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ２８．１％ （１６／５７），ｓｍｅａｒ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ３ ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ５．３％ （３／５７），ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＜０．０１）．１８ｃａ－ ｓｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｆｕｒｔｈｅｒ，４ｃａｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ，２ｃａｓｅｓ（１ｃａｓｅ Ｇｏｒｄｏｎ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ｗｅｒｅ ｒｏｐＢ ｇｅｎｅ ５２６Ｃ → Ｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｃａｓｅ ｗａｓ ｒｏｐＢ ｇｅｎｅ ５３１ Ｃ → Ｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｃａｓｅ ｗａｓ ＩｎｈＡ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－１５Ｃ → Ｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
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检 验 医 学 与 临 床 ２０１４ 年 ６ 月 第 １１ 卷 第 １２ 期 Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１２
感染也呈现增加趋势，两 者 的 病 原 菌 均 属 于 分 枝 杆 菌 属，从 形 态学、涂片抗酸染色阳 性 上 均 无 法 区 分，但 其 临 床 表 现 和 治 疗 不同。因此，ＮＴＭ 和结核分枝杆菌的病原菌鉴别亟待解决。
结核分枝杆菌耐药基因检测包括利福平ｒｐｏＢ 基因的６ 个 位点，异烟肼 ＫａｔＧ 及ｉｎｈＡ 基因启动子各１个位点。 １．３．１ 标本处理 液化根据标本类型不同，液化液（４０ ｍＬ 液 化液配方：Ｎ－乙酰半 胱 氨 酸 ０．２ｇ，８％ 柠 檬 酸 钠 ２０ ｍＬ，１０％ 氢氧化钠８ｍＬ，去 离 子 水 １２ ｍＬ）的 添 加 量 也 不 同，３７ ℃ ３０ ｍｉｎ或更长时间，直到标本完全液化；灭活，８５ ℃，３０ｍｉｎ。 １．３．２ 核酸提取 取适量标本 于 １．５ ｍＬ ＥＰ 管 中，１２ ０００ｒ／ ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加 １ ｍＬ 生 理 盐 水，混 匀，１２ ０００ｒ／ ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入８０μＬ 核酸提取 液，混 匀，转 入 核酸提 取 管 中 涡 旋 振 荡 ５ ｍｉｎ，９５ ℃ 干 浴 ５ ｍｉｎ，８ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３ ｍｉｎ，备 用 。 １．３．３ ＰＣＲ 扩 增 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 扩 增 程 序 ：２００μＬ 的 ＥＰ 管中加入１８μＬ 扩 增 液，再 加 入 ２μＬ ＤＮＡ 样 品，混 匀，瞬 时离心。扩增 条 件：３７ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ； ６０ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，４５个循环；９４ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，１０个 循环；７２ ℃ ７ｍｉｎ。结核耐药基因检测 扩 增 程 序：３ 个 ２００μＬ 的 ＥＰ 管 中 分 别 加 入 １８μＬ 扩 增 液 １、２、３，再 分 别 加 入 ２μＬ ＤＮＡ 样品，混匀，瞬时离心。扩增条件：３７ ℃ １０ｍｉｎ；９４ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ；６０ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，３５个循环；９４ ℃ ３０ｓ； ７２ ℃ ４０ｓ，１０个循环；７２ ℃ ７ｍｉｎ。 １．３．４ 芯片杂交及洗涤 扩增产物９５ ℃变性５ ｍｉｎ后，取 出 立 即冰水浴３ｍｉｎ。分枝杆菌菌种鉴定杂交程序：取６μＬ 扩增 产物加入到９μＬ 杂交缓冲液中，混匀，取１３．５μＬ 杂交液加 入 到一个芯片位点上，密封后 放 入 杂 交 仪 中，５ｒ／ｍｉｎ，５０ ℃ 杂 交 ２ｈ。结核耐药基因检测杂交程序：２个２００μＬ ＥＰ 管中分别加 入９μＬ 杂 交 缓 冲 液，１ 管 中 加 入 扩 增 产 物 １ 和 扩 增 产 物 ２ 各
检 验 医 学 与 临 床 ２０１４ 年 ６ 月 第 １１ 卷 第 １２ 期 Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１２
基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因 检测的诊断价值＊
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·论 著·
赵连爽，代 娣，陈 昕，云 科，王 倩△ （中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 １１０００１）
应用 ＤＮＡ 微阵列 芯 片 检 测 病 原 菌 核 酸 技 术 是 近 几 年 在 医 疗 领 域 最 具 影 响 的 科 技 发 展 之 一 ，可 快 速 检 测 临 床 疑 似 标 本 中 的 分 枝 杆 菌 属 ＤＮＡ［３－４］；并 且 基 因 芯 片 还 可 以 通 过 检 测 耐 药 突 变 的 存 在 与 否 协 助 判 读 结 核 菌 种 的 耐 药 情 况 ，如 异 烟 肼 耐 药 基 因 ｋａｔＧ 和ｉｎｈＡ 基因启动子及利福平耐药基因ｒｐｏＢ 等常见 突变位点［５］。为评价基 因 芯 片 技 术 在 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 及 耐 药基 因 检 测 中 的 临 床 应 用 价 值 ，本 文 回 顾 性 分 析 ９１ 例 临 床 疑 似结核 和 非 结 核 分 枝 杆 菌 病 患 者 检 测 数 据 ，现 将 结 果 报 道 如下。 １ 资 料 与 方 法 １．１ 一般资料 收集２０１２年２月至２０１３年３月中 国 医 科 大 学 附 属 第 一 医 院 门 诊 就 诊 及 住 院 的 疑 似 结 核 病 患 者 ，标 本 类 型 有 痰 液、２４ｈ 尿 液 沉 渣、胸 腹 腔 积 液、脑 脊 液 和 局 部 穿 刺 液。 其 中男性４５例，女性４６例，年龄１１～８５岁，平均年龄５１．４岁。 １．２ 仪器与试剂 应用北京博奥生物有限公司生产的分枝 杆 菌菌种鉴定 芯 片、结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 基 因 检 测 芯 片 及 ＬｕｘＳ－ ｃａｎ１０Ｋ－Ｂ 微 阵 列 芯 片 扫 描 仪 等 配 套 仪 器 进 行 检 测 。 １．３ 方法 应用芯片检测１７种分枝杆菌，包括结核分枝 杆 菌 复合群、鸟分枝杆菌、戈 登 分 枝 杆 菌、胞 内 分 枝 杆 菌、堪 萨 斯 分 枝杆菌、偶然分枝杆 菌、浅 黄 分 枝 杆 菌、土 分 枝 杆 菌、瘰 疬 分 枝 杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、不产色分枝杆菌、草分枝 杆 菌、海分枝杆菌和溃疡 分 枝 杆 菌、苏 尔 加 分 枝 杆 菌 和 玛 尔 摩 分 枝 杆 菌 、金 色 分 枝 杆 菌 、蟾 蜍 分 枝 杆 菌 、耻 垢 分 枝 杆 菌 。
目前结核病控制面临的最大问题是无法在大规模的患者中准 确、快 速 地 诊 断 出 结 核 病 患 者 ，尤 其 是 在 艾 滋 病 感 染 者 和 儿 童 中；同时合并免疫功能抑制人群增多，非结 核 分 枝 杆 菌（ＮＴＭ）
＊ 基金项目：辽宁省社会发展基金资助项目（２０１１２２５０１９）。 作者简介：赵连爽，男，本科，副主任技师，主要从事分子诊断研究。 △ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉａｎｗａｎｇｙｊ＠１６３．ｃｏｍ。
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｉｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｓｐｅ－ ｃｉｆｉｃｉｔｙ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ； ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
全球每年 新 发 病 例 超 过 ９００ 万，பைடு நூலகம் ２００ 万 人 病 死 于 结 核 病［１］。中国的结核病年发病患者约为 １３０万，每年因结核 病 病 死数达１３万，是仅次于印度的世界第２大结核病高发 国 家［２］。
【摘要】 目的 探讨基因芯片检测系统在分枝杆菌菌种鉴定及耐药基因检测中的临床应用价值。方法 应 用 基因芯片技术对疑似结核病和非结核分枝杆菌病患者的 痰 液、尿 液、胸 腹 腔 积 液、脑 脊 液 和 穿 刺 液 等 标 本 进 行 核 酸 检测；并对分枝杆菌阳性样本进行利福平及异烟肼的耐药基因检测。结果 ９１例标 本 中 共 检 出 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 １６ 例 ，非 结 核 分 枝 杆 菌 ２ 例 （戈 登 分 枝 杆 菌 １ 例 、偶 然 分 枝 杆 菌 １ 例 ），分 枝 杆 菌 检 出 总 阳 性 率 为 １９．８％ （１８／９１）， 其中结核分枝杆菌占１７．６％（１６／９１），非结核分枝杆菌占２．２％（２／９１）；不同标本类型检出阳性率有 差 别，由 高 到 低 依次为穿刺脓液（３３．３％）、痰液（２４．０％）、胸腹腔积液（１８．８％）、脑脊液（１６．７％）和尿 液（１５．８％）。 有 ５７ 例 患 者 同 时进行了基因芯片法和涂片抗酸染色法检测，其中芯片法有１６例阳 性，阳 性 率 为 ２８．１％（１６／５７），涂 片 法 有 ３ 例 阳 性，阳性率为５．３％（３／５７），两种方法比较，差异有 统 计 学 意 义 （Ｐ＜０．０１）。１８ 例 分 枝 杆 菌 阳 性 标 本 进 一 步 进 行 耐 药基因检测，有４例发生耐药基因突变，其中２例（１例 戈 登 分 枝 杆 菌）为 利 福 平 耐 药 相 关 基 因，ｒｏｐＢ 基 因 ５２６ 位 点 发生 Ｃ→Ｇ 突变，１例为ｒｏｐＢ 基因５３１位点发生 Ｃ→Ｔ 突变，还有１例为异烟肼耐药相关基因，ｉｎｈＡ 基因启 动 子－１５ 位点发生 Ｃ→Ｔ 突变；没有检测到多重耐药株。结论 基因 芯 片 技 术 适 用 于 不 同 标 本 类 型 的 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 及 耐 药 基 因 检 测 ，操 作 简 便 快 速 ，灵 敏 度 高 ，特 异 性 好 。
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ＊ ＺＨＡＯ Ｌｉａｎ－ ｓｈｕａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎ，ＤＡＩ Ｄｉ，ＣＨＥＮ Ｘｉｎ，ＹＵＮ Ｋｅ，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎ△ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ ｌｉａｏｎｉｎｇ，１１０００１，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｕｔｕｍ，ｕｒｉｎｅ，ｐｌｅｕ－ ｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ，ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃ－ ｔｅｒｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｒｉ－ ｆａｍｐｉｎ ａｎｄ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ ｆｕｒｔｈｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｍｏｎｇ ９１ｓａｍｐｌｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，１６ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ， ２ｃａｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（１ｃａｓｅ ｏｆ Ｇｏｒｄｏｎ′ｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ，１ｃａｓｅ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ），ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓ １９．８％ （１８／９１），ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ １７．６％ （１６／９１）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｎ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ２．２％ （２／９１）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆ－ ｆｅｒｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｐｕｓ，ｓｐｕｔｕｍ，ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ３３．３％ ，２４％ ， １８．８％，１６．７％ ａｎｄ １５．８％．５７ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅａｒ ａｃｉｄ－ｆａｓｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ｃｈｉｐ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ １６ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ２８．１％ （１６／５７），ｓｍｅａｒ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ３ ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ５．３％ （３／５７），ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＜０．０１）．１８ｃａ－ ｓｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｆｕｒｔｈｅｒ，４ｃａｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ，２ｃａｓｅｓ（１ｃａｓｅ Ｇｏｒｄｏｎ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ｗｅｒｅ ｒｏｐＢ ｇｅｎｅ ５２６Ｃ → Ｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｃａｓｅ ｗａｓ ｒｏｐＢ ｇｅｎｅ ５３１ Ｃ → Ｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｃａｓｅ ｗａｓ ＩｎｈＡ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－１５Ｃ → Ｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
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检 验 医 学 与 临 床 ２０１４ 年 ６ 月 第 １１ 卷 第 １２ 期 Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１２
感染也呈现增加趋势，两 者 的 病 原 菌 均 属 于 分 枝 杆 菌 属，从 形 态学、涂片抗酸染色阳 性 上 均 无 法 区 分，但 其 临 床 表 现 和 治 疗 不同。因此，ＮＴＭ 和结核分枝杆菌的病原菌鉴别亟待解决。
结核分枝杆菌耐药基因检测包括利福平ｒｐｏＢ 基因的６ 个 位点，异烟肼 ＫａｔＧ 及ｉｎｈＡ 基因启动子各１个位点。 １．３．１ 标本处理 液化根据标本类型不同，液化液（４０ ｍＬ 液 化液配方：Ｎ－乙酰半 胱 氨 酸 ０．２ｇ，８％ 柠 檬 酸 钠 ２０ ｍＬ，１０％ 氢氧化钠８ｍＬ，去 离 子 水 １２ ｍＬ）的 添 加 量 也 不 同，３７ ℃ ３０ ｍｉｎ或更长时间，直到标本完全液化；灭活，８５ ℃，３０ｍｉｎ。 １．３．２ 核酸提取 取适量标本 于 １．５ ｍＬ ＥＰ 管 中，１２ ０００ｒ／ ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加 １ ｍＬ 生 理 盐 水，混 匀，１２ ０００ｒ／ ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入８０μＬ 核酸提取 液，混 匀，转 入 核酸提 取 管 中 涡 旋 振 荡 ５ ｍｉｎ，９５ ℃ 干 浴 ５ ｍｉｎ，８ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３ ｍｉｎ，备 用 。 １．３．３ ＰＣＲ 扩 增 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 扩 增 程 序 ：２００μＬ 的 ＥＰ 管中加入１８μＬ 扩 增 液，再 加 入 ２μＬ ＤＮＡ 样 品，混 匀，瞬 时离心。扩增 条 件：３７ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ； ６０ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，４５个循环；９４ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，１０个 循环；７２ ℃ ７ｍｉｎ。结核耐药基因检测 扩 增 程 序：３ 个 ２００μＬ 的 ＥＰ 管 中 分 别 加 入 １８μＬ 扩 增 液 １、２、３，再 分 别 加 入 ２μＬ ＤＮＡ 样品，混匀，瞬时离心。扩增条件：３７ ℃ １０ｍｉｎ；９４ ℃ １０ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ；６０ ℃ ３０ｓ；７２ ℃ ６０ｓ，３５个循环；９４ ℃ ３０ｓ； ７２ ℃ ４０ｓ，１０个循环；７２ ℃ ７ｍｉｎ。 １．３．４ 芯片杂交及洗涤 扩增产物９５ ℃变性５ ｍｉｎ后，取 出 立 即冰水浴３ｍｉｎ。分枝杆菌菌种鉴定杂交程序：取６μＬ 扩增 产物加入到９μＬ 杂交缓冲液中，混匀，取１３．５μＬ 杂交液加 入 到一个芯片位点上，密封后 放 入 杂 交 仪 中，５ｒ／ｍｉｎ，５０ ℃ 杂 交 ２ｈ。结核耐药基因检测杂交程序：２个２００μＬ ＥＰ 管中分别加 入９μＬ 杂 交 缓 冲 液，１ 管 中 加 入 扩 增 产 物 １ 和 扩 增 产 物 ２ 各
检 验 医 学 与 临 床 ２０１４ 年 ６ 月 第 １１ 卷 第 １２ 期 Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１２
基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因 检测的诊断价值＊
· １５９５ ·
·论 著·
赵连爽，代 娣，陈 昕，云 科，王 倩△ （中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 １１０００１）
应用 ＤＮＡ 微阵列 芯 片 检 测 病 原 菌 核 酸 技 术 是 近 几 年 在 医 疗 领 域 最 具 影 响 的 科 技 发 展 之 一 ，可 快 速 检 测 临 床 疑 似 标 本 中 的 分 枝 杆 菌 属 ＤＮＡ［３－４］；并 且 基 因 芯 片 还 可 以 通 过 检 测 耐 药 突 变 的 存 在 与 否 协 助 判 读 结 核 菌 种 的 耐 药 情 况 ，如 异 烟 肼 耐 药 基 因 ｋａｔＧ 和ｉｎｈＡ 基因启动子及利福平耐药基因ｒｐｏＢ 等常见 突变位点［５］。为评价基 因 芯 片 技 术 在 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 及 耐 药基 因 检 测 中 的 临 床 应 用 价 值 ，本 文 回 顾 性 分 析 ９１ 例 临 床 疑 似结核 和 非 结 核 分 枝 杆 菌 病 患 者 检 测 数 据 ，现 将 结 果 报 道 如下。 １ 资 料 与 方 法 １．１ 一般资料 收集２０１２年２月至２０１３年３月中 国 医 科 大 学 附 属 第 一 医 院 门 诊 就 诊 及 住 院 的 疑 似 结 核 病 患 者 ，标 本 类 型 有 痰 液、２４ｈ 尿 液 沉 渣、胸 腹 腔 积 液、脑 脊 液 和 局 部 穿 刺 液。 其 中男性４５例，女性４６例，年龄１１～８５岁，平均年龄５１．４岁。 １．２ 仪器与试剂 应用北京博奥生物有限公司生产的分枝 杆 菌菌种鉴定 芯 片、结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 基 因 检 测 芯 片 及 ＬｕｘＳ－ ｃａｎ１０Ｋ－Ｂ 微 阵 列 芯 片 扫 描 仪 等 配 套 仪 器 进 行 检 测 。 １．３ 方法 应用芯片检测１７种分枝杆菌，包括结核分枝 杆 菌 复合群、鸟分枝杆菌、戈 登 分 枝 杆 菌、胞 内 分 枝 杆 菌、堪 萨 斯 分 枝杆菌、偶然分枝杆 菌、浅 黄 分 枝 杆 菌、土 分 枝 杆 菌、瘰 疬 分 枝 杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、不产色分枝杆菌、草分枝 杆 菌、海分枝杆菌和溃疡 分 枝 杆 菌、苏 尔 加 分 枝 杆 菌 和 玛 尔 摩 分 枝 杆 菌 、金 色 分 枝 杆 菌 、蟾 蜍 分 枝 杆 菌 、耻 垢 分 枝 杆 菌 。
目前结核病控制面临的最大问题是无法在大规模的患者中准 确、快 速 地 诊 断 出 结 核 病 患 者 ，尤 其 是 在 艾 滋 病 感 染 者 和 儿 童 中；同时合并免疫功能抑制人群增多，非结 核 分 枝 杆 菌（ＮＴＭ）
＊ 基金项目：辽宁省社会发展基金资助项目（２０１１２２５０１９）。 作者简介：赵连爽，男，本科，副主任技师，主要从事分子诊断研究。 △ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉａｎｗａｎｇｙｊ＠１６３．ｃｏｍ。
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｉｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｓｐｅ－ ｃｉｆｉｃｉｔｙ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ； ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
全球每年 新 发 病 例 超 过 ９００ 万，பைடு நூலகம் ２００ 万 人 病 死 于 结 核 病［１］。中国的结核病年发病患者约为 １３０万，每年因结核 病 病 死数达１３万，是仅次于印度的世界第２大结核病高发 国 家［２］。
【摘要】 目的 探讨基因芯片检测系统在分枝杆菌菌种鉴定及耐药基因检测中的临床应用价值。方法 应 用 基因芯片技术对疑似结核病和非结核分枝杆菌病患者的 痰 液、尿 液、胸 腹 腔 积 液、脑 脊 液 和 穿 刺 液 等 标 本 进 行 核 酸 检测；并对分枝杆菌阳性样本进行利福平及异烟肼的耐药基因检测。结果 ９１例标 本 中 共 检 出 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 １６ 例 ，非 结 核 分 枝 杆 菌 ２ 例 （戈 登 分 枝 杆 菌 １ 例 、偶 然 分 枝 杆 菌 １ 例 ），分 枝 杆 菌 检 出 总 阳 性 率 为 １９．８％ （１８／９１）， 其中结核分枝杆菌占１７．６％（１６／９１），非结核分枝杆菌占２．２％（２／９１）；不同标本类型检出阳性率有 差 别，由 高 到 低 依次为穿刺脓液（３３．３％）、痰液（２４．０％）、胸腹腔积液（１８．８％）、脑脊液（１６．７％）和尿 液（１５．８％）。 有 ５７ 例 患 者 同 时进行了基因芯片法和涂片抗酸染色法检测，其中芯片法有１６例阳 性，阳 性 率 为 ２８．１％（１６／５７），涂 片 法 有 ３ 例 阳 性，阳性率为５．３％（３／５７），两种方法比较，差异有 统 计 学 意 义 （Ｐ＜０．０１）。１８ 例 分 枝 杆 菌 阳 性 标 本 进 一 步 进 行 耐 药基因检测，有４例发生耐药基因突变，其中２例（１例 戈 登 分 枝 杆 菌）为 利 福 平 耐 药 相 关 基 因，ｒｏｐＢ 基 因 ５２６ 位 点 发生 Ｃ→Ｇ 突变，１例为ｒｏｐＢ 基因５３１位点发生 Ｃ→Ｔ 突变，还有１例为异烟肼耐药相关基因，ｉｎｈＡ 基因启 动 子－１５ 位点发生 Ｃ→Ｔ 突变；没有检测到多重耐药株。结论 基因 芯 片 技 术 适 用 于 不 同 标 本 类 型 的 分 枝 杆 菌 菌 种 鉴 定 及 耐 药 基 因 检 测 ，操 作 简 便 快 速 ，灵 敏 度 高 ，特 异 性 好 。