基因敲除的新技术_RNAi

中图分类号 : R457. 4
文献标识码 :A
文章编号 :167324130 (2007) 1121016204
基因敲除是一种反向的遗传学研究方法 ,是八十 年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术 ,是通 过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术 。 通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原 理 ,但此技术较复杂且成功率不高 。随着基因敲除技 术的发展 ,除了同源重组外 ,新的原理和技术也逐渐 被应用 ,比较成功的有基因的插入突变和 RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) ,它们同样可以达到基因 敲除的目的 。其中 RNAi 由于方法简便 ,周期较短 , 因此近几年来越来越多的基因敲除采用了 RNAi 方 法[1～3 ] 。RNAi 是指双链 RNA 诱导同源 mRNA 降解 导致基因表达抑制的现象 ,又称基因沉默. 是一种转 录后 基 因 沉 默 (po st t ranscriptio nal gene silencing , P T GS) 现象 ,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及 防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制 。
唯一可以进行长期研究 的方法
规模受到限制
可能引发非特 异的基因沉默 的表型
耗时长 , 工作 繁琐
筛选 siRNAs ,特别是需要 制备多种 siRNAs ,化学合 成的价格成为障碍时
快速而经济地研究某个基 因功能缺失的表型
可用于长期研究
实验需要大量的一个特定 的 siRNA 长期研究
长时间的研究项目 , 或者 需要 一 个 特 定 的 siRNA 进行研究 , 特别是基因治 疗
1. 化学合成 :化学合成就是将设计好的目标 siR2 NA s 序 列 交 与 专 门 的 公 司 合 成 。包 括 A mbio n 和 Otagen 公司都可以根据用户要求提供高质量的化学 合成 si RNA 。
2. 体外转录 : 通过体外转录的方法是以得到。 DNAOligo 模版 ,只要 24 h 就可以 ,不需要等很久 。 体外转录得到的 siRNA s 只要较低的浓度就可以达到 化学合成 siRNA s 较高浓度得到的效果 (0. 5～20nM vs. 50～100nm pert ransfectio n) 。
优点 方便 质量高
表 1 五种制备 siRNAs 方法的特点
缺点
适用
价格高 定制周期长
已经 找 到 最 有 效 的 siR2 NA 的情况下 ,需要大量 si RNA 进行研究
不适用
筛选 siRNA 等长 时间的 研究 ,主要原因是价格因 素
性价比高 快
跳过检测和筛 选 有 效 siRNA 序列的步骤 , 节 省时间和金钱
RNAi 基因敲除的优点
1. 比同源重组法更加简便 ,周期大大缩短 。 2. 对于哺乳动物 ,如对于一些敲除后小鼠在胚胎 时就会死亡的基因 ,可以在体外培养的细胞中利用 RNAi 技术研究它的功能 。 3. 由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达 ,它 成为研究信号传导通路的良好工具 。 4. RNAi 还被用来研究在发育过程中起作用的基 因 ,如可用 RNAi 来阻断某些基因的表达 ,来研究他 们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键 作用 。
美国麻省理工学院和哈佛大学共同领导的一个 国际性研究组最近建立了一个具有很强实用性的分 子试剂文库 ,可用来沉默绝大多数的人类和老鼠的基
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国际检验医学杂志 2007 年 11 月第 28 卷第 11 期 Int J Lab Med ,November 2007 ,Vol. 28 ,No. 11
5. si RNA 表 达 框 架 : siRNA 表 达 框 架 ( si RNA exp ressio n cassettes , SECs) 是 一 种 由 PCR 得 到 的 siRNA 表达模版 ,能够直接导入细胞进行表达而无需 事前克隆到载体中 。这个方法最早是由 Castanotto 等[5] 采用 ,包括一个 RNApol Ⅲ启动子 、一段发夹结 构 siRNA 、一个 RNA pol Ⅲ终止位点 。与 siRNA 表 达载体不同的是 ,SECs 不需要载体克隆 、测序等颇为 费时的步骤 ,可以直接由 PCR 得到 ,用时不到 1 d 。
4. siRNA 表达载体 : 多数的 siRNA 表达载体依
赖 3 种 RNA 聚合酶 Ⅲ启动子 (pol Ⅲ) 中的一种 ,操纵 一段小的发夹 siRNA 在哺乳动物细胞中的表达 。这 3 类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的 U6 启动子 和人 H1 启动子[4] 。之所以采用 RNA pol Ⅲ启动子 是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA ,而且它是通过添加一串 (3～6 个) U 来终止转 录的 。要使用这类载体 ,需要合成 2 段编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链 ,退火 ,克隆到相应载体的 pol Ⅲ启动子下游 。最近多个厂家开始研究逆转录病毒 和其他病毒载体用于 siRNA 表达 。
siRNA s 的制备方法
目前为止较为常用的 5 种制备 siRNA s 的方法包 括 :化学合成 、体外转录 、长片段 dsRNA s 经 RNase Ⅲ 类降解 (如 Dicer , E. coli ,RNase Ⅲ) 、siRNA 表达载体 或病毒载体在细胞中表达 siRNAs、PCR 制备的 siRNA
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制备方法 化学合成
体外转录
用 RNasc III 消化 长片断双链 RNA 制备 siRNA siRNA 表达载体
siRNA 表达框架
3. 用 RNase Ⅲ消化长片断双链 RNA 制备 siR2 NA :选择通常为 200～1 000 碱基的靶 mRNA 模版 , 用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ,然后用 RNase Ⅲ(或 Dicer) 在体外消化 ,得到一众 si RNA s 混 合“鸡尾酒”。在除掉没有被消化的 dsRNA 后 ,这个 siRNA 混合物就可以直接转染细胞 ,方法和单一的 siRNA 转染一样 。由于 siRNA 混合物中有许多不同 的 siRNA s ,通常能够保证目的基因被有效地抑制 。
筛选 si RNA 序列
直接由 PCR 得到 ,速度 快 ,操作简便
PCR 产百度文库物 很 难转染到细胞 中
筛选 siRNA 序列 ,在克隆 到载体前筛选最佳启动子
长期抑制研究
表达框在细胞中表达 。前面 3 种方法是在体外制备 siRNA s 后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞 ,后 两种方法则依赖能够表达 siRNA s 的 DNA 载体或者 表达框转染到细胞中 。每种方法都有自己的优点和
RNAi 的应用
1. RNAi 在探索基因功能中的应用 :人类基因组 计划的完成标志着后基因组时代的来临 ,阐明人类基 因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展 有着深远意义 。由于 RNAi 技术可以利用 siRNA 或 siRNA 表达载体快速 、经济 、简便的以序列特异方式 剔除目的基因表达 ,所以现在已经成为探索基因功能 的重要研究手段 。
缺点 (表 1) 。哪种是最好的方法 ,取决于实验目的 。 除了方法 3 以外 ,其他方法在制备 siRNA 前都
需要单独设计 siRNA 序列 。关于怎样设计 siRNA 以 及 siRNA 设计对 siRNA 功能的影响 ,尽管不断掌握 了越来越多有关设计原则的信息 ,但仍然不精确 。通 常来说 ,每个目标序列设计 3～4 对 siRNA s ,在后面 的实验中选择最有效的 1 个即可 。网上可提供免费 的 siRNA 设计工具 。
RNAi 阻断基因表达的机理
双链 RNA 进入细胞后 ,能够在 Dicer 酶的作用
作者单位 :215003 江苏省苏州大学附属儿童医院中心实验室
下被 裂 解 成 小 分 子 干 扰 RNA ( small interfering RNA ,si RNA) ,而另一方面双链 RNA 还能在 RdRP (以 RNA 为模板指导 RNA 合成的聚合酶 RNA2di2 rected RNA pot yraerase , RdRP) 的作用下自身扩增 后 ,再被 Dicer 酶裂解成 siRNA 。siRNA 的双链解开 变成单链 ,并与某些蛋白形成复合物 ,Argo naute 2 是 目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白 。此复合物 同与 siRNA 互补的 mRNA 结合 , 一方面使 mRNA 被 RNA 酶 裂 解 , 另 一 方 面 以 siRNA 作 为 引 物 , 以 mRNA 为模板 ,在 RdRP 作用下合成出 mRNA 的互 补链 。结果 mRNA 也变成了双链 RNA ,它在 Dicer 酶的作用下也被裂解成 siRNA 。这些新生成的 siR2 NA 也具有诱发 RNAi 的作用 ,通过这个聚台酶链式 反应 ,细胞内的 siRNA 大大增加 ,显著增加了对基因 表达的抑制 。从 21～23 个核昔酸的 siRNA 到几百个 核苷 酸 的 双 链 RNA 都 能 诱 发 RNAi , 但 长 的 双 链 RNA 阻断基因表达的效果明显强于短的双链 RNA 。
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·综述 ·
基因敲除的新技术 ———RNAi
金美芳 综述 朱雪明 审校
【摘要】 RNA 干扰 ( RNAi) 是一种新兴的基因阻断技术 ,它通过双链 RNA 分予介导 ,特异降解
相应序列的 mRNA ,从而导致转录后水平的基因沉默 ,自 1995 年首次报道以来已取得了重大研究进
展 。近 8 年来 ,研究者对 RNAi 现象进行了广泛 、深入的探索研究 ,预示 RNAi 有望成为今后分析人
类基因功能的有力工具 ,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用 。
【关键词】 RNA 干扰 ; 基因敲除 ; 基因沉默
RNAi 现象的发现
1995 年 , Ouo 等 发 现 注 射 正 义 RNA 和 反 义 RNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫 par2 1 基因的表达 ,该结果不能使用反义 RNA 技术的理 论做出合理解释 。直到 1998 年 , Fire 等证实 Guo 等 发现正义 RNA 抑制同源基因表达的现象是由于体外 转录制 备 的 RNA 中 污 染 了 微 量 内 源 或 外 源 双 链 RNA (do uble2st randed RNA ,dsRNA) ,而引发并将这 一现象命名为 RNAi 。此后 dsRNA 介导的 RNAi 现 象陆续发现于真菌 、果蝇 、拟南芥 、锥虫 、水螅 、涡虫 、 斑马壁等多种真核生物中 ,并逐渐证实植物中的转录 后基因沉默 、共抑制 (co supp ressio n) 及 RNA 介导的 病毒抗性 、真菌的抑带 ( quelling) 现象均属于 RNAi 在不同物种的表现形式 。
因 。这个文库由小分子 RNA 组成 ,这些小分子 RNA 可以关闭不同的基因 ,这样可以让研究者仔细分析正 常生物体或者疾病的遗传学基础 。为了检验 RNAi 文库的有效性 ,科学家分析了大约 1 000 个人类基因 样本 。他们在人类癌细胞中系统的沉默了一些在细 胞恶化过程中调节细胞分化功能的基因 。全自动的 细胞成像系统用于在成千的样品中识别细胞 。这些 方法发现除了一些已知的调节因子外 ,还发现大约 100 种未知的生长调节因子 。进一步证明了这种文库 可以作为基因发现的有效工具 。RNAi 技术使科学家 可以关闭单个的基因 , 这些小 RNA 可以和独特的 DNA 片段配对 ,抑制 DNA 的作用 ,为了使这些小 RNA 进入细胞 , 科学家把它们包裹到慢性病毒中 。 这使得它们可以进入几乎所有类型的细胞 ,这对癌症 研究尤其重要 。