沙门氏菌快速检测技术

沙门氏菌快速检测技术研究进展
摘要：沙门氏菌是食品中最常见的致病菌，是导致食物中毒的重要病原菌之一，严重危害人类的健康安全和食品安全。

传统的细菌学检测耗时繁琐，不能满足当今发展的需求。

本文简要介绍了近年来沙门氏菌快速检测技术研究进展，并分析各种检测方法的优缺点，以期寻找一种快速、简便、特异、灵敏，能检测绝大多数血清型沙门氏菌的方法。

关键词：沙门氏菌；快速检测、免疫学技术、分子生物学技术
Research Progress on the Rapid Detection of Salmonella
Zhao Hui
(College of Food Science and Engineering , Northwest A&F University , Yangling, Shaanxi 712100, China) Abstract：Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about hazard on human , The traditional bacteriology detections have not bee satisfied the requirement of development because of time -consuming. This review briefly introduced research progress of the rapid detection of Salmonella in recent years and analyzed the advantages and disadvantages of various detection methods，hoping to find a fast，simple，specific and sensitive method that could detect the majority serotypes of Salmonella．
Keywords:salmonella；rapid detection；immunological techniques；molecular biological techniques
随着国民经济的发展，食品、海产品中存在的卫生隐患问题愈发严重，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2 位，在中国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40% -60%[1]。

沙门氏菌是常见的重要食源性致病菌，它们广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖等区域，寄生在海洋生物体中，通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒，严重危害人体健康。

目前我国食品中致病菌的检验普遍采用传统的细菌学检验方法和血清学方法，这些方法一般都复杂繁琐、耗时费力，大致需要4 d~6 d 才能出检验结果，难以应对突发事件的发生。

因此，建立一些快速、简便、准确度高的检测方法一直是沙门氏菌检测研究的核心问题。

随着生物技术的进步，在食源性致病菌检测领域出现了许多比传统方法更快捷、敏感性更好的新技术，如免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。

本文总结了一些食品中沙门氏菌的快速检测方法，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，以期加快检测工作的进行[2]。

1 免疫学检测技术
在所有食品中的沙门氏菌的检测技术手段中，免疫学检测技术占有重要的地位，主要是因为其价格低廉，不需要特定的实验仪器，容易在基层推广开来。

免疫学技术以抗原和抗体的特异性结合
反应为基础，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白（抗体），再辅以免疫放大技术来进行检测。

抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成，同时由于敏感的标记技术及示踪技术的应用，使得沙门氏菌可在较短的时间内超微量而特异地检出。

目前已建立的沙门氏菌免疫学检测方法主要有以下几种：
1.1免疫荧光技术(IFT)
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理, 先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体, 再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体) 在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素, 利用荧光显微镜观察标本, 荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

免疫荧光技术主要有直接法和间接法。

直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。

直接法还可以清楚地观察抗原并用于定位标记观察。

赵文学[3]等直接将沙门氏菌固定在载玻片上,再用荧光标记抗体染色,通过荧光显微镜观察染色效果,建立了沙门氏菌直接免疫荧光检测技术,该技术染色程序简单、操作方便,具有一定的应用价值。

间接免疫荧光法在实践中用途较广，是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微进行检测。

黄愈玲[4]等人进行了间接免疫荧光技术快速检测沙门氏菌的研究,实验结果表明沙门氏菌经免疫荧光染色后,其形态结构与革兰氏染色的沙门氏菌相同，检测样品经丙酮固定化和一抗二抗分别作用30min后,用FITC标记物对其染色,通过荧光显微镜观察染色结果,检测结果与常规检测方法一致。

此检测方法具有操作简便、准确、灵敏、快速等优点,有较强的应用价值。

1.2酶联免疫吸附技术（ELISA）
酶联免疫吸附技术是建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术，具有特异性强、敏感性高等优点，可以在短时间内准确地将有害微生物检测出来。

其基本原理是把抗原（抗体）预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原（抗体），使其与结合在固相载体上的抗原（抗体）发生反应，形成抗原抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈正相关[5]。

故可根据呈色的深浅进行定性分析或通过酶标仪进行定量测定。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

20 世纪80 年代, 建立了抗沙门氏菌各种O 抗原、H 抗原单抗技术,取代常规因子血清进行血清学鉴定。

沙门氏菌研究者获得了4株具有沙门氏菌广谱结合特性的单克隆抗体,其中2株的反应互补, 对已检菌株覆盖率达到99%,而对其它受试肠杆菌均无交叉反应。

文其乙[6]等在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和de7 建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法, 并形成了快速检测试剂盒, 此外, 还应用直接ELISA 方法对500 份蛋品检测, 结果表明该方法可靠, 且阳性率比国标方法高。

田银芳等应用直接ELISA 法对350份奶样进行沙门氏菌的检测, 与常规方法相比,该法的灵敏度和特异性分别为100%和99.7%；杨爱萍等也成功地用单抗酶联试剂盒检测鲜牛奶、熟食
制品等样品中的沙门氏菌[7]。

此外Wilanee[8]等人通过碳纳米管技术结合ELISA方法检测鼠伤寒沙门氏菌,普通ELISA检测方法灵敏度为106-107CFU/rnL,为了提高检测灵敏度,采用SWCNTs标记抗体结合HRP进行检测,灵敏度提高到103-104CFU/rnL,灵敏度提高了1000多倍[9]。

大量的试验结果表明，单抗直接法灵敏度高、特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品，检测周期短，且不需昂贵仪器，易于操作，便于推广。

1.3免疫磁珠分离技术(IMS)
随着科学技术的不断发展,抗体制备技术取得了重大突破,促进了免疫磁珠的出现和发展。

免疫磁珠分离技术是一种免疫学富集分离技术,它是以高度均一的磁性微球为固相载体,免疫配基通过功能基团偶联到磁珠表面形成免疫磁球,通过抗体抗原特异性免疫学反应,在磁场力作用下,发生动力学移动,从混合溶液中富集分离目的沙门氏菌[10]。

该方法具有特异性强、分离样品快、仪器设备操作简单等特点。

IMS 法与一般的细菌培养分离方法相比，可以极大地提高环境样品与食品中病原性副溶血性弧菌的检出率。

不过，IMS目前还存在一定的局限，比如价格昂贵，且易出现交叉反应等情况，因此需要其他技术手段辅助检测。

2分子生物学技术
分子生物学检测技术具有高灵敏度、高特异性、快速准确等优点,成为生物技术革命的新产物,已经广泛应用于食源性致病菌的快速检测。

快速检测沙门氏菌的分子生物学技术主要包括:聚合酶链反应、核酸探针、基因芯片和LAMP等先进技术。

2.1聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应技术是在体外合适条件下，以DNA 为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在耐热DNA 聚合酶作用下特异性扩增目的DNA 片段的技术。

近年来应用PCR 技术检测食源性致病菌的技术有很多，如常规PCR[11]、多重PCR[12]、实时荧光定量PCR[13]等。

2.1.1多重PCR
多重PCR[14]可以在同一PCR反应体系里加入多对引物,使一次PCR反应能完成多个样品检测,提高检测效率、降低检测成本、缩短检测周期,多重PCR在病原菌检测方面得到广泛应用。

相对于传统检测方法，多重PCR 检测技术可以极大地缩短检测时间，且操作简单、特异性和敏感度较高。

邵碧英[15]等利用多重PCR技术对沙门氏菌进行检测,试验结果表明多重PCR方法比单一PCR更加准确、稳定、高效、经济。

采用多重PCR技术检测沙门氏菌,检出限为4.5×104~5.5×104cfu/ml,特异性为100%。

但是多重PCR只能进行定性检测,对定量检测的需求推动了RT-PCR技术的出现。

多重PCR 技术在实际的检验工作还存在一些问题：如提取得到的DNA 片段可能不完整，多组引物之间的相互干扰，高浓度模板对低浓度模板产生竞争性抑制以及样品中可能含有PCR 抑制物质等。

2.1.2实时荧光定量PCR（RT-PCR）
荧光定量 PCR[16,17]不同于其他 PCR 的地方在于，它不仅实现了对 DNA 的定量检测，而且具有较高的敏感性、特异性、可靠性和时效性，自动化程度高、无污染性，能够同时完成多样品的
扩增及定量，适宜于大批样品的检测。

RT-PCR[18]技术在PCR反应体系中加入荧光基团,通过分析荧光强度实现定量检测,并根据荧光信号的积累情况实时监测PCR整个扩增进程[19]。

RT-PCR技术在PCR扩增过程中即可检测目标菌的存在,不用对扩增产物进行检测,省略常规PCR技术的电泳步骤,避免了因电泳带来的误差,提高了检测准确性,并且节省检测时间。

RT-PCR与PCR技术相比,除了能进行定量检测、实时监控外,其灵敏性、特异性、重复性、检测效率都优于PCR技术,并且RT-PCR技术的整个过程都由电脑控制,操作方便,一次可以处理多个样品。

王荣成[20]杨柳[21]采用RT-PCR技术进行沙门氏菌检测,验证了其可行性。

但是PCR检测比较昂贵,特异性引物和探针的选取会影响到检测结果的准确性,因此对实验人员的专业技能和试验操作技能要求高,限制了其在基层的应用。

2.2环介导等温扩增（LAMP）
环介导恒温核酸扩增法[25]是在PCR基础上创建的一种理想的手段，该技术检测克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点，同时比传统的培养检测方法快捷方便，大大节省了工作人员的时间。

此外，这种检测方法对检测人员的技术要求较低，实际操作很简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系[26]。

该方法适用于现场检测和大量样品高通量检测，在食品卫生质量检验等领域具有广阔的应用前景。

黄金海等[27]根据沙门氏菌invA基因核苷酸序列设计一组引物，应用环介导等温扩增技术，分别对7种不同血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增，同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型，比较了LAMP 法与活菌计数检测的敏感性．与沙门氏菌培养物相比，食品中沙门氏菌的检测具有更大的难度．直接用LAMP 检测食品中的沙门氏菌面临的一个问题是不能将活菌和死菌区别开来．由于检测的灵敏性高，即使是样品中存在死亡沙门氏菌的DNA 也会产生阳性结果，所以建立能够区分死菌和活菌的方法对沙门氏菌检测较为重要．因此在LAMP 检测之前，需要选择性增菌，以减少来自样品中死亡沙门氏菌的DNA 的影响，从而增加了检测方法对样品生物安全评估的可信度，同时也提高了食品中沙门氏菌的检出率．应用建立的LAMP 方法，液体样品中沙门氏菌检出下限为336mL-1，而常规PCR 的检出线一般在103～105mL-1活菌水平。

应用建立的LAMP 方法，经增菌培养程序后，可检出含菌量为8.25g-1的阳性肉品．应用LAMP方法对沙门氏菌进行检测，从检测结果来看，方法特异、敏感，可有效检测样品中的沙门氏菌；检验周期短，每一批样品从样品准备到检出只需要2h，如果将增菌时间计算在内，也仅需要15h；操作简单，检测成本低，不需要昂贵的检测设备，检测结果肉眼可见，可适应国境口岸方便快捷的需要，在基层检测中易于推广，具有较高的实用价值．因此所建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门氏菌污染食品的快速检测。

2.3基因芯片
基因芯片又称DNA[28]芯片、生物芯片。

基因芯片检测原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针[29]杂交进行核酸序列测定的方法,将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA经PCR扩增后标记探针,然后再与芯片上寡核苷酸点进行杂交,最后通过扫描仪定量来确定检测样品是否存在目的菌[30]。

该方法具有准确度高、灵敏度高、特异性强和快速等特点,在包括沙门氏菌在内的各种致病菌检测中具有很好的应用前景。

3小结
随着生物学技术的发展，新的食品检测技术层出不穷。

这些技术与传统检测方法相比较而言，具有快速、简便、特异性强等特点。

沙门氏菌的传统检测方法对于需要检测大量样本的食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担，快速检测方法除带来检验工作本身的革新外，更重要的是由此而产生的社会效益，如减少食品库存费用、污染等问题得以尽快处理。

目前沙门氏菌的快速检测研究主要集中在PCR、核酸杂交、免疫荧光、酶联免疫ELISA 等方法上，但单纯每一种方法均存在很多缺点。

如酶联免疫吸附法能避免假阴性，但灵敏度和特异性又不及PCR；常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高。

因此，要使快速检验技术广泛应用，扩大其检验适用范围，克服假阳性和假阴性反应，考虑生产实际应用的可能性和潜在的公共卫生等问题，实现相互间的联用技术是十分必要的。

应该指出的是，快速检测方法的应用并不意味着完全抛弃分离培养方法。

在某些情况下，特别是涉及一些需要最终结果的样品时，分离培养方法还是必不可少的。

总之，随着免疫学和分子生物学的发展，相信对于食品中沙门氏菌的检测技术将向着快捷、特异性强、灵敏度高、经济实惠的方法不断发展。

[参考文献]
[1]刘喆. 沙门氏菌的检测技术进展［J］.中国动物传染病学报，2012，20( 2) :81-86.
[2]夏慧丽.食品中3种致病菌快速检测方法的研究进展.食品研究与开发[J].2012,33(8):222-224.
[3]赵文学,徐燕.直接免疫荧光法用于污水中沙门氏菌快速检验的探讨[J].中国医学检验杂志,1985,2(3):31-32.
[4]黄愈玲,李少彤,龚玉效.间接免疫荧光检测技术检测沙门菌的实验研究[J].热带医学杂志,2010,10(8):935-937.
[5]邝良德,朱晓霞,谢晓红.沙门氏菌快速检测技术概述.湖北农业科学.2011,50(2):226-228.
[6]文其乙,焦新安.直接ELISA 检测沙门氏菌方法的建立及其应用研究［J］.中国兽医学报.1995,15（2）:105－111.
[7]叶宇鑫.2011.沙门氏菌分子生物学快速检测方法研究[D].广州：华南理工大学.
[8]Wilanee Chunglok, Dyah Kinasih Wuragil, Sukunya Oaew, et al. Immunoassay based on carbon nanotubes-elthaneedn ELISA for Salmonella enterieaserovar TyPhimurium[J]. Biosensors and Bioeleetronics,2011,(26):3584-3589.
[9]Chunglok W, Wuragil D K, Oaew S, et al. Immunoassay based on carbon nanotubes enhanced ELISA for Salmonella enterica serovar Typhimurium [J].Biosensors and Bioelectronics, 2011,26(8): 3584-3589.
[10]牛瑞江. 2012.沙门氏菌富集及ELISA检测方法的研究[D].南昌:南昌大学.
[11] Chen Z，Liao Y，Ke X，et al．Comparison of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，conventional PCR and real-time PCR assays for Japanese encephalitis virus [J]．Mol Biol Rep，2011，38: 4063 -4070．
[12]XU Y G, CUI L C, TIAN C Y, et al. A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens[J]. Food Control, 2012, 25: 778-783.
[13] Fittipaldi M，Codony F，Adrados B，et al. Viable Real-Time PCR in Environmental Samples ：Can All Data Be Interpreted Directly [J].Microbial Ecology，2011，61（1）：7-12.
[14]WANG Yuexia, SUO Biao. A new 7-plex PCR assay for simultaneous detection of shiga toxin-producing Escherichia coli O157 and Salmonella enteritidis in meat products[J]. J Verbrauchersch Lebensm, 2011, 6(4): 441-447.
[15]邵碧英, 陈彬, 汤敏英, 吴谦, 张体银, 2007, 沙门氏菌多重PCR检测方法的建立,食品科学, 28(10): 489-492.
[16]RODRIGUES R, TELLES J N, ESSERE K. Development of a one step real time RT-PCR assay to detect and quantify Dugbe virus [J]. Journal of Virological Methods, 2011, 176(1/2): 74-77.
[17]LE V P, LEE K N, NGUYEN T. Development of one-step multiplex RT-PCR method for simultaneous detection and differentiation of foot-and-mouth disease virus serotypes O, A, and Asia 1 circulating in Vietnam[J]. Journal of Virological Methods, 2011, 175(1): 101-108.
[18]栗建永,赵琢,贾晓川. 食源性致病菌检测分析技术的研究进展.食品研究与开发[J].2013,34(18):110-112.
[19]周丽民,雷永良,王小光,等. 实时荧光定量PCR 技术在致病菌检测中的应用[J].标记免疫分析与临床,2012,19(5):296-299.
[20]王荣香,倪凯翔.荧光定量PCR快速检测粪便中沙门氏菌方法的建立及应用[J1.放射免疫学杂志,2010,23(3):356一359.
[21]杨柳,苏明权,马越云,等.荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立[J].中国实验诊断学,2011,15(l):17一23.
[25] Kim DW，Kilgore PE，Kim EJ，et al．The enhanced pneumococcal LAMP assay: A clinical tool for the diagnosis of meningitis due to Streptococcus pneumoniae [J]．PLoS One，2012，7: e42954. doi: 10. 1371 / journal. pone．0042954．
[26]梁艳华.环介导等温扩增在食品致病菌检测中的研究进展[J].医学动物防制,2013,29(4):391-393.
[27]黄金海，孙跃辉，陈瑞. 食品中沙门氏菌LAMP 快速检测方法的建立. 天津大学学报[J].2012,45(5):469-472.
[28] CALL D R, CHANDLER D P, BROCKMAN F. Fabrication of DNA microarrays using unmodified oligonucleotide probes[J]. Biotechniques : 30(2), 2001, 368-379.
[29]McGUINNESS S, BARRY T, O’GRADY J. Development and preliminary validation of a real-time RT-PCR based method targeting tmRNA for the rapid and specific detection of Salmonella [J]. Food Research International, 2012, 45(2): 989-992.
[30]郑大明,张静.基因芯片技术在食品微生物检测和研究中的应用[J].食品科学,2004, 25(8): 188-190.。