科学研究的一般流程

JEOL-100
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扫描电子显微镜
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子 显 微 镜型 扫 描 电
Hitachi-450
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电镜与光镜的比较
显微镜 LM 分辨本领 200nm 100nm 光源 可见光 （400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 透镜 玻璃透镜 玻璃透镜 真空 不要求真空 不要求真空 成像原理 利用样品对光的 吸收形成明暗反 差和颜色变化
磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学
（ Structural Biology ）——主要研究生物大分子空
间结构及其相互关系的主要实验手段。
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扫描电镜技术
样品在观察前，要在表面喷涂一层金膜，由电
子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探 测器收集二次电子成象，反映样品表面的形貌特征。
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光学显微镜技术
学显微镜技术
1.1 普通复式光
• 普通光学显微 镜的基本结构
普通光学显微镜的基本结构
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双筒显微镜
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倒置显微镜
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• 普通光学显微镜样品制备
★样品的固定(fixation)：甲醛或戊二醛 ★包埋和切片(embedding and sectioning)： 液态的石蜡或树脂 ★染色(staining)：苏木精( hematoxylin)对负 电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分 布；酸性染料如伊红( eosin)可使细胞质染色； 苏丹染料( Sudan dyes)在脂肪中的溶解度比在 乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使 脂肪着色。
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电子显微镜技术
2.1 电子显微镜的基本知识 电子显微镜的基本构造 电子显微镜主要由四部分组成： 电子束照明系统——电子枪、聚光镜。 成像系统——物镜、中间镜、投影镜等。 真空系统 —— 用级真空泵串连起来获得电 子显微镜镜筒中的真空。 记录系统——荧光屏和记录用的照相机。
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子 显 微型 镜透 射 电
核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察 其精细结构。
用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的 样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出 颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包 埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力 以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的 样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。负染色是只 染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。
TEM
0.1nm
电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子 的散射和透射形 成明暗反差
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2.2 主要电镜制样技术
超薄切片 技术 如同 光学显微镜， 电子显微镜 的样品也需 固定、包埋、 切片、染色 等。见P59
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负染色技术
一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、
microscopy）
(Electro microscopy) (scanning tunneling
microscope )
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分辨率指能分辨出的相邻两个质 点间的最小距离，这种距离称为分辨 距离。分辨距离越小，分辨率越高。 • 人眼的分辨率是0.2mm。 • 光学显微镜的分辨率是 0.2μm。 • 电子显微镜的分辨率是 0.2nm。
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冰冻wk.baidu.com刻技术
冰冻断裂与蚀 刻复型，即用铂、 金、碳喷涂断面， 获得样品模具而观 察。主要用来观察 膜断裂面的蛋白质 颗粒和膜表面结构 等。见P61
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电镜三维重构技术
电镜三维重构技术是电子显微术、电子衍射与 计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景 的一门新技术。
电镜三维重构技术与 X- 射线晶体衍射技术及核
装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、 显示系统。
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分 辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；
（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；
（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具 ,在原子水平上揭示样本表面的结构。
物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小 点，排除焦平面以外光的干扰，只有焦
平面的光成像，增强图像反差和提高分
辨率 1.4—1.7 倍，图像更清晰。可重构
样品的三维结构。
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1.4 相差和微分干涉显微镜技术
利用一块“相差板”，将光程差 或相位差转换成振幅差，偏振光经合 成后，使样品中厚度上的微小区别转 化明暗区别，增加了样品反差，且具 有立体感，不用染色即可用于观察活 细胞，也适于研究活细胞中较大的细 胞器等颗粒。
科学研究的一般流程
进行初步观察 形成可验证的假说 设计对照试验 查阅已 有知识 收集资料 解释结果 作出合理结论
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第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法
细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
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第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light
电子显微镜技术 扫描遂道显微镜
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第二节 细胞组分的分析方法
• • • • • • • 超离心分离细胞器与生物大分子 层析分离技术 生物大分子显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸序列定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
扫描遂道显微镜
(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等
原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量 子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在 计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。
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1.2 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
标记荧光素在激发光下以荧光成像。在光 镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定 位。如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术
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1.3 激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）