杨树分子标记研究进展

第22卷 第6期2000年11月

北 京 林 业 大 学 学 报

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Vol.22,N o.6Nov.,2000

2000 07 10收稿

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九五 国家攻关课题(96 011 02 04 02)的部分内容

杨树分子标记研究进展*

张德强 张志毅

(北京林业大学毛白杨研究所,100083,北京;第一作者男,26岁,博士生)

杨 凯

(中国农业科学院作物品种资源研究所,100081,北京)

摘要 该文介绍了在杨树育种中常用的三种分子标记:RF LP,RAP D 和A FL P,并综述了其在杨树指纹图谱、遗传图谱构建和数量性状基因定位等方面的研究进展.

关键词 杨树,分子标记,指纹图谱,遗传图谱,数量性状基因定位中图分类号 S792.11

Zhang Deqiang ;Zhang Zhiyi;Yang Kai.Advances of molecular marker researches in poplar.Jour nal of Beij ing For estry Univer sity (2000)22(6)79~84[Ch,33ref.]Institute of Pop ulus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China.

RFLP(restriction fragment length polymorphism ),RAPD(random amplified poly morphic DNAs)and AFLP (amplified frag ment length polymorphism)are introduced and their applications to finger prints,genetic linkage maps constructing and QT Ls mapping in poplar are review ed in this paper.Key words poplar,molecular marker,fingerprints,genetic maps,QT Ls mapping 杨树属杨柳科(Salicaceae )、杨属(Pop ulus L.),约有100多种,广泛分布于欧洲、北美和亚洲,是防护林、水土保持林、四旁绿化及人工用材林的重要树种.很多年来,虽然林木育种学家对其生理生化、解剖构造等基础性研究较深入,对于杨树的遗传改良产生了巨大的推动作用,但对于常规育种中抗病、抗虫性状、性别决定及林木早期选择育种等问题仍无法从根本上解决[1~6].因此,对杨树进行分子生物学研究迫在眉睫.

杨树种间杂交和无性繁殖容易,杨属所有种的染色体数均为2n=38,核基因组相对较小(2c= 1.1~1.2pg),便于遗传操作,并已建立较完善的遗传转化体系,获得了转基因植株.因此,杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种.由于杨树种间杂交容易,在F 1代有很强的杂种优势(材积生长量),杂种的F 2代在许多性状方面可发生广泛的分离,所以大量的分离群体在F 1代或F 2代很易建成[7~

10]

.十几年来,前人利用分子标记技术对杨树

基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量

性状基因定位.

在杨树中,常用的分子标记为RFLP,RAPD 和

AFLP,它们是继形态标记(M orpholog ical markers)、细胞学标记(Cytological m arkers)和生化标记(Bio chemical markers)之后发展起来的一种以DNA 多态性为基础的新一代遗传标记.与形态标记和生化标记相比,分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的,基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的,在植物发育的不同阶段,不同组织的DNA 都可用于标记分析;分子标记不受环境影响,其变异只源于等位基因DNA 序列的差异,与不良性状无必然的连锁,不需专门创造特殊的遗传材料

[7~20]

.基于上述这些优点,分子标记技术可为

杨树生产提供准确、可靠的遗传标记.

1 分子标记概述

分子标记是分子生物学发展的产物.80年代初,发展了RFLP,随后其发展极为迅速,产生了多种分子标记技术,用于杨树遗传育种的主要有以下3种.

(1)RFLP RFLP(Restriction Frag ment Length Polymorphisms)指限制性片段长度多态性,是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记[21~

25]

.

RFLP在林木遗传育种中的应用是从1986年开始的,迄今也开展了大量的研究.RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小.其基本步骤包括基因组DNA的限制性酶切,电泳分离,利用探针进行Southern杂交来检测基因组DNA.RFLP标记具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图.然而,RFLP必须经过DNA酶切、电泳、South ern杂交,费时、费力、周期长,每次实验检测的位点较少,对DNA需求量较大(5~10 g),需用放射性同位素或非放射性物质标记探针,探针的种属特异性较强,杨树已有的探针不超过300个,这是RFLP 应用在杨树中的主要问题.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区(Gaps).

(2)RAPDs RAPDs(Random Amplified Poly morphic DNAs)为随机扩增多态性DNA,是一项基于PCR技术基础之上,用一个随机引物(8~10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[7~13].与RFLP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA探针;设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好.因此,继RFLP之后,RAPD是在杨树研究中应用最广泛,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,报道最多.但是,RAPD受条件影响很大,因此对设备、条件及超作的要求都很严格,若达不到要求,稳定性和重复性就很难保证,解决的办法是严格控制实验条件,使用相同的PCR仪和引物.

(3)AFLP AFLP(Amplified Frag ment Length Polymorphisms)扩增片段长度多态性,是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau和Vos发明创造的一种DNA分子标记新技术[12,14,17,18].其基本原理是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机限制性片段,将特定的接头(adapter)连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3!末端的识别,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环而扩增,最终通过聚丙烯酰胺电泳分子筛作用,将这些特异的限制性片段分离开来.

AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起来的.它是RFLP和RAPD的结合,它集中了二者的长处,既有RFLP的可靠性,又有RAPD的方便性.也就是说它不仅具备了其它DNA分子标记技术所具有的特点,多态性丰富,共显性表达,不受环境影响,无复等位效应,而且还具有带纹丰富,用样量少,灵敏度高,快速高效等特殊优点.通过一些实验室和科学家的使用和验证,AFLP被认为是一种十分理想的、有效的分子标记技术,它可以在短时间内提供巨大的信息量.尽管它产生时间还不长,即在林木指纹图谱技术、遗传图谱构建中使用很广泛,预计AFLP在杨树分子育种中将发挥更大的作用.其缺点为:实验成本较高,基因组的不完全酶切影响实验结果,所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高,同时要求实验人员有很高的操作技能.

2 分子标记在杨树中的应用

作为一种有效的遗传标记,分子标记直接以DNA为研究对象,在杨树遗传育种方面应用广泛,分子标记在无性系指纹图谱构建、遗传图谱构建和数量性状基因定位中研究进展较快,这些开创性工作为杨树育种,利用分子标记进行辅助选择奠定了必要的理论基础.

2.1 绘制无性系指纹图谱

指纹图谱(Fing erprinting)是鉴别品种、品系和无性系(包括杂交亲本和自交系)的有力工具.90年代以前,指纹图谱构建主要是同工酶方法,而目前主要是DNA水平的分子标记技术.由于杨树分布广,在长期的自然演化和种间杂交过程中形成了生态适应性各异、数量庞大的一些变异的新种和新的无性系,为了正确地保护和利用遗传资源,应利用分子标记技术对杨树无性系鉴定进行研究,以便于在世界范围内广泛交流,为充分利用这些无性系提供一个可靠的依据.

分子标记最为直接的应用是对单株进行指纹分析,最早是利用RAPD技术进行无性系指纹图谱构建.S.Castiglione等人(1993)利用RAPD标记[26],对杨属不同种的32个无性系,进行了分析,共用18个引物并从中筛选出4个引物用于PCR扩增反应来区分这些无性系,它们共扩增出120个不同的DNA带,其中多态带占92%,通过统计分析来确定遗传关系,证明即使在形态和物候基础上不能识别的无性系,利用RAPD技术仍可鉴别出来,该研究指出,生长在不同地点的同一无性系植株其指纹没有差异.Silvia,Cortizo等人(1996)用RAPD标记技术对广泛种植在阿根廷的12种美洲黑杨进行无性系鉴定[11],结果表明:那些从形态上难以分辨的无性系,用RAPD标记可以对这些无性系进行区分;随后,N.Sanchez等人利用RAPD标记对黑杨(P.

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