氯霉素检测培训课件
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测定
LC-MS参数 GB/T20756-2006的方法液相条件如下：
LC system Column Injection Volumn
Temp
Flow rate
: Agilent 1290 RRLC : Agilent Zorbax Plus- C18, 2.1×100mm, 3.5µm : 10 µL
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技术要求及检出限
项目名称
检验依据
甲砜霉素
氟苯尼考
GB/T 207562006
氯霉素
单位表达 技术要求 检出限 ＜50.0 1.0
ug/kg ＜100.0 1.0 不得检出 0.1
注意事项
• 1.加标要加好，加对,内外标千万不要加混。 • 2 样品制备过程避免样品污染和被分析物残留量变化。 • 3 离心结束后尽快转移上清液，避免底部残渣散开，影响
2.1 实验原理
试样中的氯霉素类药物，用乙酸乙酯提取。提取 液旋转蒸干后，液相色谱仪—串联质谱仪测定， 内标法定量。
检测步骤
3.1 试样制备
从样本中取具有代表性的1kg样品，均分 为两份，装入洁净样品袋中，标记标明清 楚，取其一份用组织捣碎机绞碎均匀。
3.2试样的保存
将试样于-18℃下保存。
检测步骤
氟苯尼考 用途：动物专用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、 鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感中 芳香环上对位硝基是引起再生障碍性贫血 的主要基团，氟苯尼考在结构上以H3C－SO2取代了O2N 用药后不产生再生障碍性贫血的不良反应，因此在动物疾 病防治上，尤其是食品动物，氟苯尼考将替代氯霉素，在 兽医临床具有广阔应用前景
动物源食品中氯霉素类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T20756-2006
李兴珍 2017.12.05
主要内容
一、氯霉素类药物的介绍 二、实验原理 三、检测步骤 四、LC-MS参数 五、技术要求及检出限 六、注意事项
Page 2
氯霉素类药物介绍
氯霉素又名氯胺苯醇，是由氯链丝菌产生的一种具有抑制细 菌生长作用的广谱抗菌素，天然氯霉素是左旋体(也称左霉素)。 合成品为白色或微黄色针状或片状晶体，无臭，味极苦，稍溶于 水、乙醚和氯仿，易溶于甲醇、酒精、丙酮或乙酸乙酯，不溶于 苯和石油醚。可用于治疗伤寒菌痢、尿道感染、百日咳、肺炎、 败血症等疾病。
甲砜霉素为白色到类白色结晶性粉末或晶体，在二甲 基甲酰胺中易溶，在无水乙醇中略溶，在水中微溶。临床 上主要用于治疗呼吸、泌尿、肝胆、伤寒等肠道外科、妇 产科和五官科感染等症，特别对中轻度感染作用尤其明显 。
不良反应
• 骨髓抑制：可逆性骨髓抑制是本药最严重的不良反应。 此反应与用药剂量及疗程有关，常见于血药浓度超过 25μg/ml的患者。临床表现为贫血，并可伴白细胞和血 小板减少等。
• 其他：(1)某些先天性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶不足的患者用 药后可发生溶血性贫血；(2)长期口服给药，可能抑制肠 道菌群而使维生素K合成受阻，诱发出血倾向。
• 2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布 的致癌物清单初步整理参考，氯霉素在2A类致癌物清单 中
GB/T20756-2006实验原理
不良反应
• 神经系统：长期用药后可出现周围神经炎和视神经炎，表 现为听力减退、失眠、幻视、谵妄等神经系统症状，多属 可逆性。也有长期用药后发生视神经萎缩而致盲的报道。
• 胃肠道反应：用药后出现食欲减退、恶心、呕吐、上腹不 适和腹泻等胃肠道症状较为常见，其发生率约在10%以下
• 二重感染：长期用药后可使体内正常菌群减少，引起二重 感染。
3.3提取：
称取制备好的试样 2g（精确至0.01g）样品于 50mL 离心管中，加入内、外标准工作液和15mL 乙酸乙酯，涡旋混合均匀，超声提取 30 min， 11000 r/min 离心 10 min，取上清液于鸡心瓶中 ，下层再加入 15mL 乙酸乙酯，重复提取一次， 合并两次清液，旋转蒸发至近干，残渣用1 mL 乙腈:水（1:9）复溶，加入10ml正己烷混合均匀 ，吸取下层澄清液体过0.22um有机相过滤头，上 机LC-MS/MS测定。
: Agilent 6460 LC/MS/MS : ESI : Postive : 325℃ : 6 L/min : 45 psi : 400 ℃ : 12 L/min : 3500V : Q1 (wide) Q3 (unit) : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
: 30 ℃ : 0.3 mL/min
Mobile phase
: A-0.5%的甲酸水含5mmoL/L乙酸铵 : B-Acetonitrile
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LC-MS参数
4.2 MS Parameters
◆ MS system ◆ Ion source ◆ Polarity ◆ Source Temp ◆ Gas Flow ◆ Nebulizer ◆ Sheath Gas Temp ◆ Sheath Gas Flow ◆ Capillary ◆ Resolution ◆ Scan mode
• 再生障碍性贫血：用药后发生再生障碍性贫血者罕见。 其临床表现有血小板减少引起的出血倾向，并发淤点、 淤斑和鼻出血等，以及由粒细胞减少所致感染征象，如 高热、咽痛、黄疸等。
• 灰婴综合征：尚未发现早产儿及新生儿有使用本药致“ 灰婴综合征”的报道，仅有出现短暂性皮肤和面色苍白 的个案报道。
• 肝毒性：原有肝病者用药后可能引起黄疸、肝脂肪浸润 、甚至急性重型肝炎。
后续操作。 • 4 控制好旋蒸温度和压力，避免速度过快导致被分析物损
失。 • 5 操作过程中严禁涂抹护手霜等含有氯霉素类药物的护肤
产品。 • 6 整个实验操作过程中须在通风橱内进行，佩戴好适合的
劳动防护用品，既保护自己也确保实验的准确性。
检测步骤
3.4标准曲线的绘制
标准溶液配制的浓度为0.1ng/mL 、0.2 ng/mL、 0.5ng/mL、1 ng/mL 、2 ng/mL的标准工作液，浓 度由低到高进样检测，以定量离子峰面积为纵坐标， 以浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。
3.5空白试验 取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行
LC-MS参数 GB/T20756-2006的方法液相条件如下：
LC system Column Injection Volumn
Temp
Flow rate
: Agilent 1290 RRLC : Agilent Zorbax Plus- C18, 2.1×100mm, 3.5µm : 10 µL
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技术要求及检出限
项目名称
检验依据
甲砜霉素
氟苯尼考
GB/T 207562006
氯霉素
单位表达 技术要求 检出限 ＜50.0 1.0
ug/kg ＜100.0 1.0 不得检出 0.1
注意事项
• 1.加标要加好，加对,内外标千万不要加混。 • 2 样品制备过程避免样品污染和被分析物残留量变化。 • 3 离心结束后尽快转移上清液，避免底部残渣散开，影响
2.1 实验原理
试样中的氯霉素类药物，用乙酸乙酯提取。提取 液旋转蒸干后，液相色谱仪—串联质谱仪测定， 内标法定量。
检测步骤
3.1 试样制备
从样本中取具有代表性的1kg样品，均分 为两份，装入洁净样品袋中，标记标明清 楚，取其一份用组织捣碎机绞碎均匀。
3.2试样的保存
将试样于-18℃下保存。
检测步骤
氟苯尼考 用途：动物专用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、 鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感中 芳香环上对位硝基是引起再生障碍性贫血 的主要基团，氟苯尼考在结构上以H3C－SO2取代了O2N 用药后不产生再生障碍性贫血的不良反应，因此在动物疾 病防治上，尤其是食品动物，氟苯尼考将替代氯霉素，在 兽医临床具有广阔应用前景
动物源食品中氯霉素类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T20756-2006
李兴珍 2017.12.05
主要内容
一、氯霉素类药物的介绍 二、实验原理 三、检测步骤 四、LC-MS参数 五、技术要求及检出限 六、注意事项
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氯霉素类药物介绍
氯霉素又名氯胺苯醇，是由氯链丝菌产生的一种具有抑制细 菌生长作用的广谱抗菌素，天然氯霉素是左旋体(也称左霉素)。 合成品为白色或微黄色针状或片状晶体，无臭，味极苦，稍溶于 水、乙醚和氯仿，易溶于甲醇、酒精、丙酮或乙酸乙酯，不溶于 苯和石油醚。可用于治疗伤寒菌痢、尿道感染、百日咳、肺炎、 败血症等疾病。
甲砜霉素为白色到类白色结晶性粉末或晶体，在二甲 基甲酰胺中易溶，在无水乙醇中略溶，在水中微溶。临床 上主要用于治疗呼吸、泌尿、肝胆、伤寒等肠道外科、妇 产科和五官科感染等症，特别对中轻度感染作用尤其明显 。
不良反应
• 骨髓抑制：可逆性骨髓抑制是本药最严重的不良反应。 此反应与用药剂量及疗程有关，常见于血药浓度超过 25μg/ml的患者。临床表现为贫血，并可伴白细胞和血 小板减少等。
• 其他：(1)某些先天性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶不足的患者用 药后可发生溶血性贫血；(2)长期口服给药，可能抑制肠 道菌群而使维生素K合成受阻，诱发出血倾向。
• 2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布 的致癌物清单初步整理参考，氯霉素在2A类致癌物清单 中
GB/T20756-2006实验原理
不良反应
• 神经系统：长期用药后可出现周围神经炎和视神经炎，表 现为听力减退、失眠、幻视、谵妄等神经系统症状，多属 可逆性。也有长期用药后发生视神经萎缩而致盲的报道。
• 胃肠道反应：用药后出现食欲减退、恶心、呕吐、上腹不 适和腹泻等胃肠道症状较为常见，其发生率约在10%以下
• 二重感染：长期用药后可使体内正常菌群减少，引起二重 感染。
3.3提取：
称取制备好的试样 2g（精确至0.01g）样品于 50mL 离心管中，加入内、外标准工作液和15mL 乙酸乙酯，涡旋混合均匀，超声提取 30 min， 11000 r/min 离心 10 min，取上清液于鸡心瓶中 ，下层再加入 15mL 乙酸乙酯，重复提取一次， 合并两次清液，旋转蒸发至近干，残渣用1 mL 乙腈:水（1:9）复溶，加入10ml正己烷混合均匀 ，吸取下层澄清液体过0.22um有机相过滤头，上 机LC-MS/MS测定。
: Agilent 6460 LC/MS/MS : ESI : Postive : 325℃ : 6 L/min : 45 psi : 400 ℃ : 12 L/min : 3500V : Q1 (wide) Q3 (unit) : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
: 30 ℃ : 0.3 mL/min
Mobile phase
: A-0.5%的甲酸水含5mmoL/L乙酸铵 : B-Acetonitrile
Page 11
LC-MS参数
4.2 MS Parameters
◆ MS system ◆ Ion source ◆ Polarity ◆ Source Temp ◆ Gas Flow ◆ Nebulizer ◆ Sheath Gas Temp ◆ Sheath Gas Flow ◆ Capillary ◆ Resolution ◆ Scan mode
• 再生障碍性贫血：用药后发生再生障碍性贫血者罕见。 其临床表现有血小板减少引起的出血倾向，并发淤点、 淤斑和鼻出血等，以及由粒细胞减少所致感染征象，如 高热、咽痛、黄疸等。
• 灰婴综合征：尚未发现早产儿及新生儿有使用本药致“ 灰婴综合征”的报道，仅有出现短暂性皮肤和面色苍白 的个案报道。
• 肝毒性：原有肝病者用药后可能引起黄疸、肝脂肪浸润 、甚至急性重型肝炎。
后续操作。 • 4 控制好旋蒸温度和压力，避免速度过快导致被分析物损
失。 • 5 操作过程中严禁涂抹护手霜等含有氯霉素类药物的护肤
产品。 • 6 整个实验操作过程中须在通风橱内进行，佩戴好适合的
劳动防护用品，既保护自己也确保实验的准确性。
检测步骤
3.4标准曲线的绘制
标准溶液配制的浓度为0.1ng/mL 、0.2 ng/mL、 0.5ng/mL、1 ng/mL 、2 ng/mL的标准工作液，浓 度由低到高进样检测，以定量离子峰面积为纵坐标， 以浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。
3.5空白试验 取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行