分子信标的原理及应用

分子信标的原理及应用

医学实验05级 韩晓（主笔） 张旭 田野 王跃樊

摘要 在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针，用以进行定性和定量检测。分子信标技术的建立正是满足了人们的需求，因而这种技术很快就广泛地应用于基础医学和生物学等诸多领域。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的灵敏度。本文介绍了分子信标的原理、影响分子信标的主要因素、分子信标的标记和设计原则、新型分子信标以及分子信标的应用。

关键词 分子信标 分子信标的结构和原理 影响分子信标的主要因素 分子信标的标记 分子信标的设计 波长移动分子信标 分子信标的基本应用 应用实例

正文 1996 年Tyagi 和Kramer 报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针——分子信标(molecular beacon)，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。在临床诊断、基因检测它的优势。

等领域，分子信标也越来越显示出基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状态时，

分子信标呈发卡式结构，首先介绍分子信标的结构和原理。分子信标是一种荧

光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构

上，分子信标大体上可以分为三部分（如图）：（1）环状

区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；

（2）茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶

分子结合过程中可发生可逆性解离；（3）荧光基团和淬灭

基团：荧光基团一般连接在5ˊ端，淬灭基团一般连接在3

ˊ端。

根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光

从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而分子信标的荧光几乎100%恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。

在影响分子信标的主要因素中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度。Bonnet等研究温度对分子信标影响时发现，体系的荧

光强度呈现为一个先减弱后增强的过程。就此，Bonnet等做出如下解释：

如图，在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1状态，发出荧光。随着温度升高，分子信标中，

通过杂交后荧光信号的与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态，从而荧光强度减弱。温度持续增高，将导致分子信标熔链即S3状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。其次，环境、pH值也是影响分子信标的一个因素。pH值过高，分子信标的发卡结构可能被破坏，出现假阳性结果。此外，分子信标的纯度，也将对分子信标产生影响。

分子信标通常都是修饰以一个单一的发光基团。在一个均相体系变化，一种分子信标即可检测一种靶序列。为了实现在一个均相体系中同时检测多种靶序列的目的，可将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。例如，Tyagi 等利用四种不同的分子信标进行等位基因检测。这四个信标分子环状区同一位置的一个碱基组成不同，所连接的荧光基团则分别具有不同的激发波长和发射波长。将四种分子信标等量混合放入四个试管中，并分别加入靶序列。只有与靶序列完全匹配的分子信标才能发生特异性结合，并在相应

激发波长下发射出荧光。而且完全匹配序列的稳定性明显高于单碱基错配的序列。显然，应用这种方法，需要根据具体的荧光基团采用不同波长的激发光源和在不同的特定波长处采集相应的荧光信号。

在实验中，分子信标的设计遵循如下几条原则：(1)环状序列比茎杆序列长两倍以上，茎杆-shi 序列不能过长或过短；(2)茎杆序列中G 和C 的含量不能太高；(3)5’端的第一个碱基最好不要选择G；(4)由于被测对象DNA 或RNA 是大分子，存在扭曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容易接近的那段序列来设计信标；(5)荧光猝灭依赖的是能量共振转移,而转移的效率与荧光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧光能有效猝灭,荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激发光谱，符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有EDANS 和DABCYL、6-荧光素和DABCYL、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸等。

为了采用单一激发光源,Tyagi 等还报道了一种称之为波长移动分子信标(wavelength fting molecular beacon)的分子信标标记方法，在这种分子信标中，吸收激发光能量和将所吸收的能量以荧光发射出去的是两个独立的荧光基团，即荧光吸收基团和荧光发射基光。他们采用DABCYL 作为猝灭基团联结在分子信标探针的3’端,荧光素分子作为荧光吸收基团联结在5’端中间相应位置，5’末端联结德克萨斯红(TexasRed)等荧光发射基团。分子信标中荧光基团与猝灭基团紧密结合，彼此共用电子，形成一个暂时的无荧光复合体，并将吸收的荧光以热能的形式散发出去。在这种复合体中，能量从荧光吸收分子传递到猝灭基团的速度远远高于由于荧光共振能量转移而引起的能量传递速度。在与目标序列结合前波长转移分子信标保持发夹结构，荧光吸收分子所吸收的能量由猝灭基团以热能的形式发射出去。然而在与目标序列结合之后，荧光吸收基团与猝灭基团分开，其所吸收的能量被传递给荧光发射基团，荧光发射基团再将能量以自己的特征波长发射荧光。结果表明，这种波长转移分子信标不仅能在单一波长激发下获得较高的荧光效率，

而且保持了分子信标的高特异性团。其结构如图所示。在单一光源激发下，荧光发射基团可在可见光谱区发出不同波长的荧