第七章：分离分析导论

三、基本理论
塔板理论 定义：把整个色谱柱比拟为一座分馏塔，把色谱的分离过程 比拟为分馏过程，直接引入分馏过程的概念、理论和方法来 处理色谱分离过程的理论。 • 该理论实际为半经验理论，把色谱柱假想成一个分馏塔，由 许多彼此独立的塔板组成，每一塔板的柱长为塔板高度（ H ）；在每一塔板内，一部分空间由固定相占据，另一部分由 流动相占据，流动相占据的空间称为板体积（△V）；在每一 塔板上，物质在流动相和固定相之间立即建立起分配平衡。 • 这里假定色谱柱由5块塔板(n=5)组成,并以r表示塔板编号,r 等于0、1、2、…n-1，某组分的分配比k=1，若对单位量的物 质 进 行 分 配 ， 在 0 号 塔 板 上 分 配 平 衡 后 ， 因 为 k=1, 所 以 mS=mM=0.5；当有一个板体积的流动相进入并达平衡之后， 有0.5单位的物质进入 1 号塔板, 且在流动和固定相中各占 0.25 单位的物质。(如下)
• 范底姆特方程： 总述：
H：A+B/u+Cu= H 2d p
2D g u
[
1 k
2 0.01k 2 d p 2
Dg

31 k Dl
2
2kd 2 f
]u
• 影响柱效及H是由多种因素选择决定：
1.拄种类C毛细管柱或填充拄 2.拄填充均匀性 3.载体的颗粒度 4.载气种类及Mr 5.固定液,液膜厚度,均匀性 6.拄温,拄形状等......
• 分离分析法与食品科学的关系：食源性疾 病、恶性食品污染事件、食品生产加工新 技术与新工艺、食品贸易纠纷 • 分离分析法优点：食品基质、样品含量、 样品共存物
石油醚
• 分离原理：当混合物随流动相 流经色谱柱时，就会与柱中的 固定相发生作用（溶解、吸附 等），由于混合物中各组分物 植 理化学性质和结构上的差异， 物 与固定相发生作用的大小、强 色 素 弱不同，在同一推动力作用下， 各组分在固定相中的滞留时间 不同，从而使混合物中各组分 按一定顺序从柱中流出。
峰高
h
峰面积 A 峰拐点 E、F 峰宽 前伸峰 a、d 拖尾峰 b、c 分叉峰 e ―馒头”峰 f wb 半峰宽 w1/2
色谱保留值
死时间t:(GC中的空气峰)死体积V0 t0 F0 保留时间tR (受固定抽,柱温,流动相流速率影响)保留体积VR =tRF0 调整保留时间t1 =t -t 调整保留体积V1 t1 F R R 0 R R 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
定义：把整个色谱柱比拟为一座分馏塔，把色谱的 分离过程比拟为分馏过程，直接引入分馏过程的概 念、理论和方法来处理色谱分离过程的理论。
该理论的特点引入H（塔板高度） n=L/H (塔板层数)
理论塔板数N=5.54 (
tR 2 t ) 16( R ) 2 y1/ 2 y
• H与u的关系是双曲线，当H对u的一阶导数为零时， 得到最佳线速uop，将uop代入板高线速方程可以得到最 小板高为：
B H A Cu u
dH B 2 C 0 du u
H min A 2 BC

u op
B C


由图还可以看出：当 u<uop时,B/u起主要作用 当u>uop时,Cu起主要作用 当u=uop时,有最小板高 在实际中,为提高分析速度,采用的线速常大于最佳线速。
速率理论—范第姆特方程（动力学理论） • 定义：在塔板理论的基础上，结合影响 塔板高度H的动力学因素，即综合考虑组 分分子的纵向分子扩散和组分分子在两 相间的传质过程等因素，提出 H=A+B/u+Cu（范第姆特方程式） A：涡流扩散顶； B/u：分子扩散项； Cu：传质阻力项
A：涡流扩散顶
• 产生原因：组分分子碰到 固定相小颗粒，改变前进 方向，垂直流动产生“涡 流”，造成峰形变宽。 • 决定因素：取决于柱子的 填充不均匀因子λ和固定相 颗粒大小dp • A=2λdp ，对空心毛细管柱， A=O
1
i .s 2.1 R 1
L u t0
流动相 平均线速度
柱长
1
相对保留值r2,1或ri,s：在相 同操作条件下，组分2(或i)， 与参比组分1（或s）的调 整保留值比 。
r2.1
t
i .s 2.1 R 1
t
1 R (2) 1 R (1)

V
V
1 R (2) 1 R (1)
分配平衡；色谱分析中，在一定温度下，组分在 流动相和和固定相之间所达到的平衡为分配平衡 ， 以分配系数K 与分配比k’表示。
例 1 ：已知一色谱柱在某温度下的速率方程的 A=0.08cm; B=0.65cm2/s; C=0.003s, 求最佳线速 度u和最小塔板高H. 解: H=A+B/u+Cu 欲求 u最佳和H最小,要对速率方程微分,即 dH/du＝d(A+B/u+Cu)/du＝-B/u2+C＝0 最佳线速: u最佳＝(B/C)1/2 ＝(0.65/0.003)1/2＝14.7cm/s
k’又称为容量因子、容量比、分配容量， k’越大，说明组分在 色谱柱中停留的时间越长，对该组分来说，相当于柱容量大。
色谱流出曲线上的信息
色谱峰的应用
1 根据色谱峰的个数，可判断样品所含的最少 组份数。 2 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。 3 根据色谱峰的面积或峰高, 可以进行定量分析 4 色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱 分离效能的依据 5 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(或流动 相)选择是否合适的依据。
流动相
柱内谱带构型
填充拄 : 有固相颗料阻挡,扩散小r<1 空心毛细管拄:r=1
相应的响应信号
Cu：传质阻力项
• 流动相传质阻力系数Cm： 指组分分子从流动相移 向固定相表面进行两相 之间的质量交换时所受 到的阻力。
• Cm=
0.01k 12 dp 2 1 2 (1 k ) Pg
采用减少固定相颗粒 dp或增加流动相扩散系数 Dg （即相对 分子质量小的流动相）来降低Cm，提高柱效 。
4
0 0 0 0 0.063 0.157 0.235 0.274 0.274 0.247 0.207 0.151 0.110 0.08 0.057 0.040 0.027
柱出口
0 0 0 0 0 0.032 0.079 0.118 0.138 0.138 0.124 0.104 0.076 0.056 0.040 0.028 0.020
第七章 分离分析法导论
石油醚(流动相)
碳酸钙 (固定相)
一、概 述
• 分离分析法：通过试样中共存组分间的吸 附、分配、交换、迁移速率以及其他性能 上的差异，先将样品分离然后进行分析的 仪器分析方法。而后通过检测器，按一定 顺序进行分析测定。 • 分类：气相色谱、液相色谱、纸色谱、薄 层色谱、超临界流体色谱。高效毛细管电 泳法，色谱一质谱联用、色谱 —— 光谱、 波谱联用
2
0 0 0.25 0.375 0.375 0.313 0.235 0.165 0.111 0.072 0.045 0.028 0.016 0.010 0.005 0.002 0.001
3
0. 0 0 0.125 0.25 0.313 0.313 0.274 0.22 0.166 0.094 0.070 0.049 0.033 0.022 0.014 0.008
固定相传质阻力系数Cs：指组分分子在进入固定相扩 散到固定相内部，达到分配平衡后，又回到界面，再 逸出界面，被流动相带走这一过程所受到的阻力。
2k 1 df 2 Cs= 1 2 3(1 k ) Ds
减少df 固定相液膜厚度 措施： →可减少Cs 增大组分在固定相中的扩散等系Ds(y增高拄温)
A 2 d p
B/u：分子扩散项
• 产生原因：浓度梯 度差形成分子的纵 向扩散，从而引起 峰形变宽
流动相
柱内谱带构型
影响因素： 流动相流
速、气体扩散系数Dg
相应的响应信号
B=2Dg
拄温 2 1 D : 组分在流动相中的扩散系数cm S 拄压 流动相种类,性质有关 在气相中,D是液相中的105倍
对总述方程的求导：dH/du=-B/u2+C=0
u最佳 B / c H 最小 A 2 BC
流动相线速度对板高的影响 B H A Cu u
LC:由于纵向扩散 小，H与u简单， B/u很小； GC: 低流速，H反比于 u,即B/u影响大些； 高流速时，Cu对 H的影响更大
由于t0v0不参与分配过程
1 t1 t 2 R R 2 ( ) 16( ) N有效=5.54 y y 1/ 2 L H有效= n有效
有效塔板数消除 了死时间影响
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理 论 塔 板 高 度
L H n
色谱柱长度 理论塔板数
柱效能 指标

当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内 被分配的次数越多，柱效能越高，所 得色谱峰越窄。
分配系数K ：组分在两相之间达到分配平衡时，该组分在两 相中的浓度之比是一个常数 CS
CM
K= K越大，与固定相的作用力越强， 前进速率越慢，tR就越长
ns cs v s vs 分配比k’：溶质在两相中物质的量之比 k’= K nm cm vm vm
k’= 分配比与保留值的关系 ：
1 t1 t t v v v R R 0 R R 0 t0 t0 v0 v0
( Dg
1 ) 高的载气流速 M 载气 低的柱温、
分子质量较大的气体做载气
（弯曲因子 ）：与填充物有关，填 充物的存在使分子自由扩散的能力降 低；填充物填充的均匀性对弯曲因子 影响不是主要的，只要有填充物存在， 影响流动相路径弯曲的因素和减小分 子扩散的因素就存在。
Dg:流动相的扩散系 数.流动相的粘度和 相对分子量越小，组 分在其中的扩散系数 越大；温度越高扩散 系数越大
塔板理论－柱分离效能指标
塔板号
载气塔板体积数
0
1 0.5 0.25 0.125 0.063 0.032 0.016 0.008 0.004 0.002 0.001 0 0 0 0 0 0
1
0 0.5 0.5 0.375 0.25 0.157 0.095 0.056 0.032 0.018 0.010 0.005 0.002 0.001 0 0 0
叶绿素分离实验
分 类
色谱分析法
按流动相状态分 按操作形式分
气相色谱
液相色谱
超临界流体色谱 填充柱色谱
纸色谱 薄层色谱
按固定相状态分
毛细管柱柱色谱
按分离原理分
气固色谱
气液色谱 按固定相状态分 吸附色谱 液固色谱 液液色谱 分配色谱
离子交换色谱 凝胶色谱
平板色谱
二、常用术语
色谱图：即试样经色谱柱分离成不同组分后， 组分在检测器上产生的信号强度对时间t所 作的图。
指导选择分离操作的依据
柱效与u的关系
LC：由于纵向扩散小， 2γDg/u 可忽略不 计，u、H关系简单
H 2d p 2D g u [
1 k
2 0.01k 2 d p 2
Dg

31 k Dl
2
2kd 2 f
]u
低流速,H反比于U, 即B/U影响大些 GC：纵向扩散大 高流速时,(H U)CU项对H影响更大
一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在
色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离， 但不能说明组分间分离的好坏，因为分离好坏决定 于各组分在流动相和固定相之间分配系数的差别， 而不是分配次数的多少。
反映柱效能，但n和n有效都是针对具体物质而言 n、H、K关系 n越大，H越小，柱效能越高，分离得越好，但分离最终 决定于K，只有在K有差别情况下，改变n、H才能提高柱 效，达到分离。 缺点 ①忽略组分在纵向上的扩散； ②K与浓度的关系被忽略； ③假设分配平衡为瞬间到达; 待解决问题 ①不能解释不同流速，n不同； ②峰展宽； ③操作条件如何影响分离效果
• • • •
基线： 噪声： 色谱峰高度、宽度、面积： 峰高：峰的最大值以峰底的距离（可用纸高度 mm ，电 信号mA、mv表示。） • 峰宽： 标准偏差、峰底宽Y、半峰宽Y1/2 • 峰面积A：色谱峰与峰底之间的面积
积分仪计算 对称峰:A=1.065hY1/2 手工计算 Y0.15+Y0.85 非对称峰 :A=1.065h 2