抗体纯化大全

抗体的纯化

第一节 硫酸铵沉淀法

基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

试剂及仪器

组织培养上清液、血清样品或腹水等

硫酸铵（ ）

饱和硫酸铵溶液（ ）

蒸馏水

含 叠氮钠 见附录一

透析袋

超速离心机

计

磁力搅拌器

实验步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 。

一、配制饱和硫酸铵溶液（ ）

将 （ ） 边搅拌边慢慢加到 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到 。

此即饱和度为 的硫酸铵溶液（ ）；

其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表 ；

二、沉淀

、样品（如腹水） 离心 ，除去细胞碎片；

、保留上清液并测量体积；

、边搅拌边慢慢加入等体积的 到上清液中，终浓度为 ： （ ）；

、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 小时或搅拌过夜（ ），使蛋白质充分沉淀。

三、透析

、蛋白质溶液 离心 （ ）。弃上清保留沉淀；

、将沉淀溶于少量（ ） 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 叠氮钠透析 小时（ ），每隔 小时换透析缓冲液一次，以

彻底除去硫酸氨；

、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

应用提示

一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

、边搅拌边慢慢加 到样品溶液中，使浓度为 ；

、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 小时 或过夜（ ）；

、 离心 （ ），保留上清液；

、上清液再加 到 ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 ，同前透析，除去硫酸氨；

、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；

二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 ）；

三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。

参考文献

、

、 库珀着，徐晓利主译《生物化学工具》 人民卫生出版社出版（ ）， 。

（夏泉）

表 室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（ ）提高到终浓度（ ）时需加硫酸氨的量（ ）

第二节 离子交换层析法

基本原理

离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。

是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过 柱时，带负电荷的蛋白质可以被 吸

附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择 值大于待纯化抗体等电

点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于 离子交换剂上，然后用增加盐浓度

的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。本文以

腹水中 的纯化为例来介绍此方法。

试剂及仪器

抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体）

离子交换剂（阴离子交换剂）

层析柱（ ）

缓冲液 ： 缓冲液 ：

缓冲液 ：

缓冲液 ：

见附录一

透析袋

磁力搅拌器

蠕动泵和部分收集器

紫外检测仪

梯度发生器

电导仪

计

离心机

实验步骤

整个层析过程最好在 进行 可在冷室操作；

、抗体样品对缓冲液 透析过夜（ ）；

、按说明处理 离子交换剂。然后用缓冲液 平衡。用 倍体积缓冲液 洗交换剂，可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液 ；

、将处理好的 离子交换剂悬浮在缓冲液 中，装入层析柱。

、用等体积的缓冲液 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液 的离子强度一致；

、稀释后的样品 离心 （ ），除去沉淀变性的蛋白质；

、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；

、抗体样品以 流速上柱，然后用缓冲液 洗柱 ，将未吸附的蛋白质洗出。直到流出液在 的吸光度小于 ；

、吸附的蛋白质，用连续增加 的浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液（ ）或分段缓冲液（ 、 、 、 、 ）洗脱。流速 ，分部收集洗脱液 管 （图 ）；

、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对 含 叠氮钠 透析或冷冻（视抗体的稳定性而定）；

、 离子交换剂可按照商品说明再生使用。

图 离子交换柱层析纯化小鼠

流速： 样品： 腹水

检测方法

、大部分小鼠的单克隆抗体 可在 浓度之间洗脱。

、可用 或定量免疫学方法（ 、 ）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。

实验要点及说明

、要得到满意的分离结果，每 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过 。

、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。

、如抗体与 离子交换剂不能有效的结合，可将起始缓冲液的 提高 个单位 直到可以有效结合为止。

、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。洗脱液每管收集 然后用分光光度计测定各管 波长的吸光度值。

、该方法可按比例扩大。用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。

参考文献

、张保真编译西安医科大学出版（ ）《免疫组织化学理论与技术》 。

（夏泉）