红霉素生产工艺的现状与展望_李雷
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在人类与致病微生物的斗争历史上，以抗生素为代 表的微生物药物起到了至关重要的作用。红霉素是一类 广泛使用、用于治疗革兰氏阳性菌感染的广谱大环内酯 类抗生素。其临床应用领域的扩大和以阿奇霉素、罗红霉 素、克拉霉素等为代表的新型半合成红霉素的出现，快速 拉动了红霉素原料药的生产需求。
自红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来， 以提高其产生菌种发酵单位为目的的遗传育种工作一直 未曾停止。由于对微生物次级代谢产物生物合成的机制 了解不多，常规诱变选育的方法存在周期长、效率低和随 机性大的缺点，近年来在红霉素高产菌株的筛选方面收效
范代娣等[20]在研究红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵 水平的影响中，通过正交试验得到了优化的发酵温度为 前期温度35℃，中期温度31℃，后期温度（29±0.5）℃。同时， 得到优化的前期和中期pH 值均为6.8。利用均匀设计，得 出了优化补料配方，使效价提高约3.8%。由试验得到了一 组优化的摇床转速控制方式和优化的前体添加水平。通过 这些工艺条件的优化，使摇瓶发酵红霉素效价提高约47.3%。 宋小锋等[21]考察了不同温度对红色糖多孢菌合成红霉素 的影响，并对不同温度条件下的发酵过程进行了动力学 特性分析，得出了红霉素合成的变温培养方法为延滞期及 对数期初期33℃，发酵中期32℃，发酵后期29℃。采用此方 法进行发酵，红霉素的生物效价和化学效价比恒温32℃培 养对照组分别提高了11.1%和24%。同时得出，采用前期 31℃，中期32℃，后期29℃变温发酵，不仅在一定程度上节 约水源、能源、保护环境和降低成本，而且提高了红霉素的
.Department. of Bioengineering , Sichuan University of Science and Engineering , Zigong 643000, China)
Abstract: Strains, optimization of medium, optimization of technical parameters, and the optimization of extraction process of fermentation, extraction process of erythromycin are summarized. The current research situation and the future of erythromycin was analyzed and prospected. Key words: erythromycin; fermentation technology; biosynthesis; pretreatment
应惟娲等[17]用Minimum Run Equireolicated Res IV设 计对红色糖多孢茵产红霉素初始发酵培养基添加的6个 影响因素的效应进行评价，得出4个显著影响的因素，即甜 菜碱、硫酸镁、硫酸铜和氯化钴。再用最陡爬坡实验为中 心组合实验确定最大响应区间，经过最后响应面分析得到 最优化结果，甜菜碱0.0185%（w/v），硫酸镁0.106%（w/v），
摘 要：文章主要从4个方面（菌种、培养基优化、工艺参数控制优化和提取工艺优化）对红霉素发酵、提取工艺优化研究进行了总结。 分析了红霉素的研究现状并对今后红霉素的研究做出了展望。 关 键 词：红霉素；发酵工艺；生物合成；预处理
中图分类号：Q935
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2012）09-0013-04
最近，红霉素产生菌S. erythraea基因组序列的公布， 使得基因工程改造红霉素产生菌成为研究的热点。主要 采用基因工程手段对红霉素途径中的后修饰酶、聚酮合成 酶和代谢节点基因进行改造，并取得了较好的效果[10-11]。 2.2 培养基的影响
卞晨光等[12]在摇瓶培养过程中，培养基中加入豆油可 使红霉素的效价从3038U/mL（不加豆油）提高为5221U/mL。 同时也得出红色糖多孢菌的摇瓶培养基中使用不同的有 机氮源红霉素的效价明显不同，得到有机氮源中的苏氨 酸为影响红霉素效价的主要因子[13]。杨莲芳等[14]也得出在 发酵培养基中加入一定量的植物油可以提高红霉素产 量。并得出不同种类的植物油对红霉素影响程度不同， 依次为菜籽油>花生油>大豆油> 玉米油>芝麻油>茶油> 橄榄油≈蓖麻油>棉籽油。一般认为油脂作为碳源提高抗 生素产量的原因主要有2点：一是油脂是一种疏水性物质， 在水中的溶解度很小，因此油脂可作为缓慢利用的碳源避 免迅速利用碳源引起的分解代谢物的阻遏作用；二是能够 为抗生素提供所需要的前体，提高短链脂肪酸的合成[12]。 培养基中含有无机磷会显著抑制了红霉素的生物合成[15]， 但往培养基中添加一定量的锌盐可以一定程度地提高红 霉素A 的效价和含量[16]。
目前国内红霉素成本高、品质低、污染大，引导国产红 霉素产业走出这个“怪圈”的关键之一就是优质的菌种。 但 是 由 于 利 益 与 专 利 等 问 题 ，很 多 研 究 学 者 都 对 自 己 的菌种保密。这就阻碍了研究进展，使菌种的问题迟迟不 能解决。
李武德等[8]采用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）对出 发菌株HD07-30进行双重复合诱变选育筛选耐红霉素的 高产菌株，取得了比较好的效果，获得红霉素抗性突变菌 株，生物效价比出发菌株提高27%。虞龙等[9]将氯化锂、紫 外、离子束3种不同诱变方式结合起来进行复合诱变，快速 有效地获得较理想的一株高产稳产优良菌株，该菌株摇瓶 效价达7126U/mL，较出发菌株提高了20.3%。
不大。随着分子生物学技术的发展，国际上在红霉素产生 菌种的基因工程改造方面进行了诸多尝试；然而，这些研 究主要集中在与红霉素产生相关的底物供应或限制因素 的改进方面，并未就红霉素生物合成的次生代谢途径做 特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中经常面临 的有效组分偏低等问题时，以至于缺乏有效的针对性。 2 生产工艺优化研究现状
红 霉 素（erythromycin，Er）是 红 色 糖 多 孢 菌（Saccharopolyspora erythraea）的次级代谢产物，为十四元大环内 酯类抗生素（包括ErA~ErF[1]，ErA的抑菌活性最高）。其抗 菌谱和青霉素G相似，特别对抗酸杆菌、革兰氏阳性细菌、 大病毒及立克次氏体有抗菌活性，是治疗溶血性链球菌感 染和耐药性金黄色葡萄球菌感染所引起疾病的首选药 物，同时红霉素衍生物的兴起，大大刺激了母体红霉素的 需求[2-5]。我国红霉素发酵属低水平重复操作，与发达国 家 相 比差距较大，国外发酵单位已达8000U/mL~ 12000U/mL[2，5]。 由于这些原因造成我国生产红霉素的利润很低。为此我 国学者为提高红霉素发酵水平在红霉素发酵、提取工艺优 化方面作了较多研究工作。 1 总体研究现状
硫酸铜0.106mmol/L，氯化钴0.0003%（w/v）。最终得到优化 后红霉素生物效价比优化前提高了30%[17]。
为降低生产成本，张金国等[5]选用A粉和B粉代替原 工艺中的淀粉及部分葡萄糖和豆饼粉。得到发酵过程中 菌丝形态和主要生化指标与原工艺相比均无明显差异， 使用A粉和B粉的罐批仅在发酵前期观察到产生的泡沫较 多，适当控制搅拌和通气量可解决；发酵后期很少出现稀 化，放罐时发酵液黏度明显增大，对发酵液的预处理非常 有利以及提高发酵液的生物效价和提高其稳定[5]。
Er的生物合成过程中，由ErD转化成ErA有2条路径： ErD→ErB→ErA或ErD→ErC→ErA，若能对其甲基化和 羟基化过程同时进行适度强化，则能提高Er A的相对含 量。L-苏氨酸和L-丝氨酸可作为羟基化试剂补入发酵液， 强化羟基化过程；L-蛋氨酸作为甲基化试剂补入发酵液， 强化甲基化过程；Mn2+和Mg2+可提高Er合成过程中关键酶 的活性；补入微量ATP可给有自溶趋势的菌体直接提供维 持能，并促进菌丝适度生长；发酵后期加入柠檬酸则可适 度强化TCA循环，为Er生物合成提供足够中间体。故向发 酵液添加上述因子，既强化了基础代谢，又在合适时期，特 别是发酵后期强化了次级代谢的关键步骤，提高了ErA的 相对含量，一定程度上实现了Er组分生物转化的优化[4，19]。
发酵是红霉素生产过程的一个关键环节，具有操作 经验的操作者通过生产过程的信息和经验知识，随时调 整补加营养物料和基质，使得微生物沿着的理想的生长 代谢方式进行；在发酵过程中，尽管对环境的参数，如发 酵温度、pH值、溶解氧浓度（DO）等都可以控制得很好，但 是由于微生物生长过程是高度的时变性和非线性，发酵 过程中的关键变量，如总糖浓度、菌丝浓度不可在线测 量，使得发酵过程的控制问题变得很复杂[3]。ErA是红霉素 的主要活性成分，而ErB和ErC生物活性低，副作用大，欧 洲药典规定其在红霉素产品中的含量不能超过5%。因此， 提高红霉素发酵液中ErA的含量和纯度，降低副 产物 ErB、ErC含量，是当前红霉素生产的一个重要问题[6]。发酵 液中杂质多，通过简单的预处理很难完全去除，导致红霉 A、B、C的分离效果不好，常用的预处理方法在萃取红霉素 时又会造成很大损失[7]。 2.1 菌种的影响
专论与综述
中国酿造
2012 年 第 31 卷 第 9 期
总第 246 期
·15·
发酵生产水平。 赵见喜等[22]指出发酵工艺优化的基本思路不应任然
是寻求培养基的最优配方和最佳的温度、pH值、DO 等的 静态调控，因为本质上的过程优化往往需要以代谢流为 控制点，通过动态优化以达到目的。通过对多种在线的直 接、间接参 数 以 及 离 线 的 手 工 参 数 进 行 检 测 ，通 过 相 关 分析得出生理调控的工艺参数和生物合成过程中的代谢 流分布之间的联系，从而在代谢流的水平指导发酵过程， 实现实时的动态优化从而大幅度提高发酵生产水平。
Situation and expectation of erythromycin production process
LI Lei1, REN Yongli2, LI Yang3, FANG Chunyu3, ZUO Yong3*
(1.Sichuan Province Wine-brewing Research Institute, Guanghan 618300, China; 2.Sichuan Wenjun Distillery Co., Ltd., Qionglai 611530, China;
不同的菌株适应环境的能力不同，因此，不同的生产 菌种的发酵培养基也就不同。每当对生产菌株进行改造 之后都得找到一个与之相适应的培养基。龚文静等[18]通过 正交试验得到，影响红霉素高产突变株N5发酵液的生物 效价的因素大小顺序为玉米浆>淀粉>豆油>葡萄糖>硫酸 铵，说明玉米浆对红霉素高产突变株N5发酵液的生物效 价的影响最大；最佳发酵培养基条件为葡萄糖3%，淀粉 3%，玉米浆0.15%，硫酸铵0.7%，豆油0.3mL/25mL。 2.3 工艺参数控制
优质菌种才能生产高质量的抗生素，但国内目前使
收稿日期：2012-05-31 基金项目：四川省教育厅成果培育项目（11ZZ016） 作者简介：李 雷（1986-），男，四川盐亭人，助理工程师，主要从事白酒生产技术和白酒品评工作；左 勇*，副教授，通讯作者。
2012 Vol.31பைடு நூலகம்No．9
·14· Serial No．246
专论与综述
中国酿造
2012 年 第 31 卷 第 9 期
总第 246 期
·13·
红霉素生产工艺的现状与展望
李 雷1，任永利2，李 杨3，方春玉3，左 勇3*
（1.四川省酿酒研究所，四川 广汉 618300；2.四川省文君酒厂有限责任公司，四川 邛崃 611530； 3.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）
China Brewing
Forum and Summary
用的菌种生产效率偏低，相当部分产品由于纯度的不足， 制约了国产红霉素出口和进军更高端抗生素市场—红霉 素有效组分ErA进一步加工成高附加值的衍生药物后，其 市场价格可提升数十至上百倍。同时，杂质的处理和由此 带来的分离纯化等问题，也使企业在应对日益突出的环 境污染方面面临更大的压力。
自红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来， 以提高其产生菌种发酵单位为目的的遗传育种工作一直 未曾停止。由于对微生物次级代谢产物生物合成的机制 了解不多，常规诱变选育的方法存在周期长、效率低和随 机性大的缺点，近年来在红霉素高产菌株的筛选方面收效
范代娣等[20]在研究红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵 水平的影响中，通过正交试验得到了优化的发酵温度为 前期温度35℃，中期温度31℃，后期温度（29±0.5）℃。同时， 得到优化的前期和中期pH 值均为6.8。利用均匀设计，得 出了优化补料配方，使效价提高约3.8%。由试验得到了一 组优化的摇床转速控制方式和优化的前体添加水平。通过 这些工艺条件的优化，使摇瓶发酵红霉素效价提高约47.3%。 宋小锋等[21]考察了不同温度对红色糖多孢菌合成红霉素 的影响，并对不同温度条件下的发酵过程进行了动力学 特性分析，得出了红霉素合成的变温培养方法为延滞期及 对数期初期33℃，发酵中期32℃，发酵后期29℃。采用此方 法进行发酵，红霉素的生物效价和化学效价比恒温32℃培 养对照组分别提高了11.1%和24%。同时得出，采用前期 31℃，中期32℃，后期29℃变温发酵，不仅在一定程度上节 约水源、能源、保护环境和降低成本，而且提高了红霉素的
.Department. of Bioengineering , Sichuan University of Science and Engineering , Zigong 643000, China)
Abstract: Strains, optimization of medium, optimization of technical parameters, and the optimization of extraction process of fermentation, extraction process of erythromycin are summarized. The current research situation and the future of erythromycin was analyzed and prospected. Key words: erythromycin; fermentation technology; biosynthesis; pretreatment
应惟娲等[17]用Minimum Run Equireolicated Res IV设 计对红色糖多孢茵产红霉素初始发酵培养基添加的6个 影响因素的效应进行评价，得出4个显著影响的因素，即甜 菜碱、硫酸镁、硫酸铜和氯化钴。再用最陡爬坡实验为中 心组合实验确定最大响应区间，经过最后响应面分析得到 最优化结果，甜菜碱0.0185%（w/v），硫酸镁0.106%（w/v），
摘 要：文章主要从4个方面（菌种、培养基优化、工艺参数控制优化和提取工艺优化）对红霉素发酵、提取工艺优化研究进行了总结。 分析了红霉素的研究现状并对今后红霉素的研究做出了展望。 关 键 词：红霉素；发酵工艺；生物合成；预处理
中图分类号：Q935
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2012）09-0013-04
最近，红霉素产生菌S. erythraea基因组序列的公布， 使得基因工程改造红霉素产生菌成为研究的热点。主要 采用基因工程手段对红霉素途径中的后修饰酶、聚酮合成 酶和代谢节点基因进行改造，并取得了较好的效果[10-11]。 2.2 培养基的影响
卞晨光等[12]在摇瓶培养过程中，培养基中加入豆油可 使红霉素的效价从3038U/mL（不加豆油）提高为5221U/mL。 同时也得出红色糖多孢菌的摇瓶培养基中使用不同的有 机氮源红霉素的效价明显不同，得到有机氮源中的苏氨 酸为影响红霉素效价的主要因子[13]。杨莲芳等[14]也得出在 发酵培养基中加入一定量的植物油可以提高红霉素产 量。并得出不同种类的植物油对红霉素影响程度不同， 依次为菜籽油>花生油>大豆油> 玉米油>芝麻油>茶油> 橄榄油≈蓖麻油>棉籽油。一般认为油脂作为碳源提高抗 生素产量的原因主要有2点：一是油脂是一种疏水性物质， 在水中的溶解度很小，因此油脂可作为缓慢利用的碳源避 免迅速利用碳源引起的分解代谢物的阻遏作用；二是能够 为抗生素提供所需要的前体，提高短链脂肪酸的合成[12]。 培养基中含有无机磷会显著抑制了红霉素的生物合成[15]， 但往培养基中添加一定量的锌盐可以一定程度地提高红 霉素A 的效价和含量[16]。
目前国内红霉素成本高、品质低、污染大，引导国产红 霉素产业走出这个“怪圈”的关键之一就是优质的菌种。 但 是 由 于 利 益 与 专 利 等 问 题 ，很 多 研 究 学 者 都 对 自 己 的菌种保密。这就阻碍了研究进展，使菌种的问题迟迟不 能解决。
李武德等[8]采用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）对出 发菌株HD07-30进行双重复合诱变选育筛选耐红霉素的 高产菌株，取得了比较好的效果，获得红霉素抗性突变菌 株，生物效价比出发菌株提高27%。虞龙等[9]将氯化锂、紫 外、离子束3种不同诱变方式结合起来进行复合诱变，快速 有效地获得较理想的一株高产稳产优良菌株，该菌株摇瓶 效价达7126U/mL，较出发菌株提高了20.3%。
不大。随着分子生物学技术的发展，国际上在红霉素产生 菌种的基因工程改造方面进行了诸多尝试；然而，这些研 究主要集中在与红霉素产生相关的底物供应或限制因素 的改进方面，并未就红霉素生物合成的次生代谢途径做 特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中经常面临 的有效组分偏低等问题时，以至于缺乏有效的针对性。 2 生产工艺优化研究现状
红 霉 素（erythromycin，Er）是 红 色 糖 多 孢 菌（Saccharopolyspora erythraea）的次级代谢产物，为十四元大环内 酯类抗生素（包括ErA~ErF[1]，ErA的抑菌活性最高）。其抗 菌谱和青霉素G相似，特别对抗酸杆菌、革兰氏阳性细菌、 大病毒及立克次氏体有抗菌活性，是治疗溶血性链球菌感 染和耐药性金黄色葡萄球菌感染所引起疾病的首选药 物，同时红霉素衍生物的兴起，大大刺激了母体红霉素的 需求[2-5]。我国红霉素发酵属低水平重复操作，与发达国 家 相 比差距较大，国外发酵单位已达8000U/mL~ 12000U/mL[2，5]。 由于这些原因造成我国生产红霉素的利润很低。为此我 国学者为提高红霉素发酵水平在红霉素发酵、提取工艺优 化方面作了较多研究工作。 1 总体研究现状
硫酸铜0.106mmol/L，氯化钴0.0003%（w/v）。最终得到优化 后红霉素生物效价比优化前提高了30%[17]。
为降低生产成本，张金国等[5]选用A粉和B粉代替原 工艺中的淀粉及部分葡萄糖和豆饼粉。得到发酵过程中 菌丝形态和主要生化指标与原工艺相比均无明显差异， 使用A粉和B粉的罐批仅在发酵前期观察到产生的泡沫较 多，适当控制搅拌和通气量可解决；发酵后期很少出现稀 化，放罐时发酵液黏度明显增大，对发酵液的预处理非常 有利以及提高发酵液的生物效价和提高其稳定[5]。
Er的生物合成过程中，由ErD转化成ErA有2条路径： ErD→ErB→ErA或ErD→ErC→ErA，若能对其甲基化和 羟基化过程同时进行适度强化，则能提高Er A的相对含 量。L-苏氨酸和L-丝氨酸可作为羟基化试剂补入发酵液， 强化羟基化过程；L-蛋氨酸作为甲基化试剂补入发酵液， 强化甲基化过程；Mn2+和Mg2+可提高Er合成过程中关键酶 的活性；补入微量ATP可给有自溶趋势的菌体直接提供维 持能，并促进菌丝适度生长；发酵后期加入柠檬酸则可适 度强化TCA循环，为Er生物合成提供足够中间体。故向发 酵液添加上述因子，既强化了基础代谢，又在合适时期，特 别是发酵后期强化了次级代谢的关键步骤，提高了ErA的 相对含量，一定程度上实现了Er组分生物转化的优化[4，19]。
发酵是红霉素生产过程的一个关键环节，具有操作 经验的操作者通过生产过程的信息和经验知识，随时调 整补加营养物料和基质，使得微生物沿着的理想的生长 代谢方式进行；在发酵过程中，尽管对环境的参数，如发 酵温度、pH值、溶解氧浓度（DO）等都可以控制得很好，但 是由于微生物生长过程是高度的时变性和非线性，发酵 过程中的关键变量，如总糖浓度、菌丝浓度不可在线测 量，使得发酵过程的控制问题变得很复杂[3]。ErA是红霉素 的主要活性成分，而ErB和ErC生物活性低，副作用大，欧 洲药典规定其在红霉素产品中的含量不能超过5%。因此， 提高红霉素发酵液中ErA的含量和纯度，降低副 产物 ErB、ErC含量，是当前红霉素生产的一个重要问题[6]。发酵 液中杂质多，通过简单的预处理很难完全去除，导致红霉 A、B、C的分离效果不好，常用的预处理方法在萃取红霉素 时又会造成很大损失[7]。 2.1 菌种的影响
专论与综述
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2012 年 第 31 卷 第 9 期
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发酵生产水平。 赵见喜等[22]指出发酵工艺优化的基本思路不应任然
是寻求培养基的最优配方和最佳的温度、pH值、DO 等的 静态调控，因为本质上的过程优化往往需要以代谢流为 控制点，通过动态优化以达到目的。通过对多种在线的直 接、间接参 数 以 及 离 线 的 手 工 参 数 进 行 检 测 ，通 过 相 关 分析得出生理调控的工艺参数和生物合成过程中的代谢 流分布之间的联系，从而在代谢流的水平指导发酵过程， 实现实时的动态优化从而大幅度提高发酵生产水平。
Situation and expectation of erythromycin production process
LI Lei1, REN Yongli2, LI Yang3, FANG Chunyu3, ZUO Yong3*
(1.Sichuan Province Wine-brewing Research Institute, Guanghan 618300, China; 2.Sichuan Wenjun Distillery Co., Ltd., Qionglai 611530, China;
不同的菌株适应环境的能力不同，因此，不同的生产 菌种的发酵培养基也就不同。每当对生产菌株进行改造 之后都得找到一个与之相适应的培养基。龚文静等[18]通过 正交试验得到，影响红霉素高产突变株N5发酵液的生物 效价的因素大小顺序为玉米浆>淀粉>豆油>葡萄糖>硫酸 铵，说明玉米浆对红霉素高产突变株N5发酵液的生物效 价的影响最大；最佳发酵培养基条件为葡萄糖3%，淀粉 3%，玉米浆0.15%，硫酸铵0.7%，豆油0.3mL/25mL。 2.3 工艺参数控制
优质菌种才能生产高质量的抗生素，但国内目前使
收稿日期：2012-05-31 基金项目：四川省教育厅成果培育项目（11ZZ016） 作者简介：李 雷（1986-），男，四川盐亭人，助理工程师，主要从事白酒生产技术和白酒品评工作；左 勇*，副教授，通讯作者。
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红霉素生产工艺的现状与展望
李 雷1，任永利2，李 杨3，方春玉3，左 勇3*
（1.四川省酿酒研究所，四川 广汉 618300；2.四川省文君酒厂有限责任公司，四川 邛崃 611530； 3.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）
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Forum and Summary
用的菌种生产效率偏低，相当部分产品由于纯度的不足， 制约了国产红霉素出口和进军更高端抗生素市场—红霉 素有效组分ErA进一步加工成高附加值的衍生药物后，其 市场价格可提升数十至上百倍。同时，杂质的处理和由此 带来的分离纯化等问题，也使企业在应对日益突出的环 境污染方面面临更大的压力。