SNP检测方法

一大类是以单链构象多态性(SSCP) 、变性梯度凝胶电泳(DDGE) 、酶切扩增多态性序列(CAPS) 、等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法

另一大类是以直接测序DNA芯片变性、高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量自动化程度较高的检测方法。

1.单链构象多态性(SSCP)

方法的原理是PCR扩增的DNA片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链DNA扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于DNA单链的空间构象决定着其迁移率，相同长度的DNA单链，若某单个碱基存在差异，则形成迥然不同的空间构象，就会显示出带型的差异(多态型) 。优点：该方法简便灵敏快速成本低

缺点：PCR-SSCP适用于小的DNA片段，长度小于500 bp，如果DNA片段太长，DNA单链很难形成稳定发夹结构。但是该方法只能对突变进行较为粗略地检测，不能确定突变的具体位置和类型；而且对电泳条件的要求非常严格。

2.变性梯度凝胶电泳(DDGE)

在DNA序列中，4种碱基的组成和排列存在差异，致使不同序列的DNA双链有着不同的解旋温度当DNA分子在含浓度梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于解旋的状况与其序列高度相关，使得不同DNA片段形成相互分开的条带。

DGGE利用双链DNA分子在含有一定浓度梯度变性剂的凝胶中进行电泳时，由于存在突变的双链DNA分子和不存在突变的双链DNA分子在不同的部位解旋而区分即使只有一个碱基对的不同，两个双链DNA分子在不同的时间发生部分解旋，随之形成有差异的电泳条带。由于存在突变DNA片段和正常DNA 片段的Tm值有差异，从而发生迥然不同的解旋行为，TGGE通过设置温度梯度在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离DNA差异片段。

优点：DGGE能够检测长达1 kb的DNA片段，若SNP恰好出现在发生部分解旋的DNA区域内，其检出率可以高达100%，特别是100~500 bp长度的片段。

缺点：该方法也只能对突变进行较为粗略地检测，一般不能确定突变位置和类型。

3.酶切扩增多态性序列(CAPS)

CAPS又称为PCR-RFLP CAPS是将PCR技术与RFLP技术相结合，利用DNA片段在酶切位点上碱基的变异，采用相应的限制性内切酶，对该DNA

片段的PCR扩增产物进行酶切，因而产生多态性。CAPS首先是对目标SNP所在的DNA片段设计特异性引物并对其进行扩增，然后用限制性内切酶对该DNA 片段的PCR扩增产物进行酶切，再通过凝胶电泳进行检测，形成分子标记。对于那些不能转化成为CAPS的SNP，可以将其转化为衍生酶切扩增多态性。

优点：如共显性、位点特异性高、操作较简单和成本较低等。

缺点：仅仅能够检测出位于酶切位点处的SNP，对位于酶切位点以外的SNP的检测则无法实现。

4.等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)

AS-PCR的原理是由于Taq DNA聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。每个SNP的检测都需要根据其具体位点设计三条不同的引物，其中一条是通用的引物，另两条是分别对应SNP位点的两个等位基因的特异性引物。对PCR产物进行电泳检测后，通过电泳条带的有和无就可以确定SNP的基因型。理论上，引物3'末端的碱基与DNA模板发生完全互补配对时，DNA 聚合酶才能使扩增有效地进行；但实际上，在一些情况下即使引物3'末端的碱基与DNA模板不能够发生完全的互补配对，但是延伸仍然可以发生。为解决这一问题，人为地在3'末端倒数第二或第三位引入错配碱基能够显著提高引物的特异性。

目前，已出现了基于AS-PCR改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR、片段长度差异等位基因特异PCR、多等位基因特异扩增。

优点：AS-PCR具有简便快速能对SNP进行分型以及费用低等优点。

缺点：该方法由于特异性引物的稳定性差，对扩增条件要求比较严格，所以操作比较繁琐，因此不适于高通量SNP的检测，只适于较小规模SNP的检测。