棉花精氨酸脱羧酶基因GhADC1克隆与表达分析

4期
李亚栋等院棉花精氨酸脱羧酶基因
1 克隆与表达分析
293
总 RNA袁 并用 DNase I 去除总 RNA 中的 DNA遥 3'Race 操作进行两轮嵌套 PCR 完成遥用天根公司
按照 Clotech SmartTM Race 试剂盒 3'Race 操作合 试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标产物袁连接
棉 花 学 报 Cotton Science 2013袁25渊4冤院291~299
棉花精氨酸脱羧酶基因
1 克隆与表达分析
李亚栋 1袁默辉娟 1袁王省芬 1袁孙艳香 1,2*袁马峙英 1*
渊1. 河北农业大学 / 河北省作物种质资源重点实验室袁河北 保定 071001曰
2. 廊坊师范学院遗传与育种研究所袁河北 廊坊 065000冤
1 was higher in leaves than that in stems and roots, respectively, and
was higher in the leaves of the resistant cotton variety Jiman 20 than that in those of the tolerant cotton variety Zhong 521. Fur-
2181 bp袁共编码 726 个氨基酸袁其中 N 端具有叶绿体定位信号肽遥 推测的 GhADC1 蛋白具有 PLP 结合位点及
Orn/Dap/Arg 脱羧酶的信号位点袁属于典型的 III 型 PLP 依赖型精氨酸脱羧酶家族成员遥 荧光定量 RT-PCR 结
果表明袁正常条件下袁
1 在叶片中表达量高于茎和根部组织袁且在抗黄萎病品种冀棉 20 中的表达水平
的合成究竟以 ADC 还是 ODC 途径为主袁不同植
物间存在差异遥 在拟南芥渊
冤等
十字花科植物中还未见存在 ODC 及其编码基因
的确切证据[5]遥 由于植物是唯一可经 ADC 途径进
行 Put 合成的高等真核生物袁 且 ADC 是植物在
胁 迫条件 下形 成多胺的 第一 个 限 速酶 [3]袁 因此 其
册 号 分 别 为 DT551682.1尧DT549429.1尧 Bootstrap 分析 以 使得 分 枝 的 结 果 更 可靠 遥 用
DT560584.1尧DT566343.1 和 DT048833.1遥 将所获 ChloroP1.1渊http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/冤
与植物农艺性状的关系始终被学者关注遥 当前袁
水稻渊
冤[6]尧康乃馨(
)[7]尧凯尔盖朗甘蓝渊
冤[8]尧苹
果渊
冤[9]等多种植物的
基因
已被克隆和鉴定遥 利用基因工程技术证明异源过
表达
基因可提高转基因植物耐盐渍尧 干旱
能力以及抗病能力袁这为植物抗性的遗传改良提
供了新方法[10]遥
与其在非生物胁迫响应中的研究相比袁
高于耐病品种中 521曰黄萎病菌胁迫能够快速诱导抗病品种根部
1 表达袁而在耐病品种中未见明显差
异袁推测在抗病品种中
1 可能参与根部对黄萎病菌胁迫的早期应答遥
关键词院棉花曰精氨酸脱羧酶基因曰多胺曰黄萎病菌曰基因表达
中图分类号院S562.035.3 文献标志码院A
文章编号院1002-7807渊2013冤04-0291-09
BA 等信号分子的生成等遥 在盐渍等非生物胁迫
下袁多胺可调控 Ca2+ 稳态尧作为 K+ 通道或转运蛋
白的野封阻剂冶调节植物体 K+/Na+ 的平衡[3] 曰多胺
还 可 诱 导 活 性 氧 的 产 生 和 Ca2+ 内 流 袁 激 活
MAPKs 蛋白激酶袁开启过敏反应渊HR冤及相应的
防御机制[4]遥 结合态多胺可稳定逆境胁迫下核酸尧
成 cDNA 第一链用于基因的克隆袁用 Takara 公司 pGEM T-easy 载体袁 将阳性克隆送与上海生工生
MMLV 反转录酶合成 cDNA 第一链进行基因表 物技术有限公司进行测序验证遥
达分析遥
分 析 所 用 序 列 均 来 自 NCBI 数 据 库 (http:
以 本实 验室 构 建的 陆地 棉 抗黄 萎病 品 种 //www.ncbi.nlm.nih.gov/)袁 用 ClustalW (http://
SSH 文库中的一条 EST 为基础袁利用同源序列检 www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行氨基酸序列比对袁用
索并结合电子克隆技术袁筛选 NCBI 棉花 EST 数 MEGA5.10 软件进行系统进化分析袁进化树利用
据库袁获得 5 条 EST 序列袁其在 GenBank 上的注 Neighbor-Joining 方法 构建袁 其中 进行 1000 次
的陆地棉品种为材料袁分析该基因在根尧茎尧叶中
的表达及黄萎病胁迫下根中的表达模式袁为探明
抗黄萎病分子机理及抗病品种改良提供依据遥
材料与方法
试验材料与处理 采用的抗黄萎病品种为冀棉 20[2]尧耐病品种 为中 521袁两个品种均为陆地棉渊 L.冤遥 黄萎病菌菌株为本实验室分离鉴定的临 西 2-1 株系袁属强致病力菌株[12]遥 将经表面消毒的棉花种子植于无激素 MS 培养基中袁在条件为 28/25 益渊昼 / 夜冤尧16 h 光照 的组织培养室中培养至 2 叶 1 心期袁采用分生孢 子悬浮液蘸根法接种黄萎病菌袁即在无菌条件下 将幼苗轻轻拔出并浸泡在黄萎病菌孢子悬浮液 中 3 min袁 然后将处理后的幼苗重新移栽到新的 MS 培养基中生长遥 取接种病菌前植株的根尧茎尧 叶作为 0 h 对照袁用于不同组织表达差异分析曰同 时取根作为 0 h 对照袁与接种后 12尧24尧36尧48尧96 h 的根系一起用于黄萎病菌诱导后基因表达水平 检测遥 cDNA 的分离与序列分析 依据天根公司 RNAplant 试剂操作说明提取
1, GenBank accession no. KC851856,
an arginine decarboxylase gene was cloned from upland cotton using bioinformatics and RT-PCR technologies. The full-length
pendent arginine decarboxylase protein family. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction results showed that,
under untreated conditions, the expression level of
LI Ya-dong1, MO Hui-juan1, WANG Xing-fen1, SUN Yan-xiang1,2*, MA Zhi-ying1*
渊1.
065000,
冤
071001,
; 2.
Based on a sequence in a suppression subtractive hybridization library,
参与植物细胞分化尧形态建成尧程序凋亡尧胁迫响
应等诸多生物学过程[3]遥 其在植物体内主要以游
离态存在袁此外也可通过与核酸尧蛋白质尧羟基肉
桂酸等物质作用而以结合态形式存在遥 游离态多
胺可作为渗透调节剂尧活性氧清除剂参与植物渗
透胁迫响应[3]袁也可作为激素尧信号分子等参与多
种胁迫响应信号的调控袁如乙烯的调控袁诱导 A-
a putative N-terminal chloroplast-targeting signal peptide. Conserved domain analysis showed that
1 contained a PLP
binding site and an Orn/Dap/Arg decarboxylase signal site. These characteristics indicated that it belongs to the type III PLP-de-
是多种胁迫反应中的信号分子袁也调节包括细胞
伸长尧极性生长尧气孔活动和花的发育等植物生
长发育进程[Fra Baidu bibliotek]遥
多胺的生物合成始于 Put 的产生遥 在植物体
内存在两种 Put 合成途径袁 一种是精氨酸在精氨
酸脱羧酶渊Arginine decarboxylase, ADC冤催 化下
脱羧生成鲱精胺袁再经两步酶促反应脱去一分子
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棉花学报
25 卷
多胺渊Polyamines, PA冤是生物体代谢过程中
产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱袁
广泛存在于原核和真核生物中遥 高等植物中常见
的 多胺 主 要 有 腐 胺 渊Putrescine, Put冤尧 亚 精 胺
渊Spermidine, Spd冤尧精胺渊Sperrnine, Spm冤等袁广泛
氨生成 Put曰 另一种是精氨酸先脱去一分子脲生
成鸟氨酸袁再由鸟氨酸脱羧酶渊ODC冤催化脱羧生
成 Put遥 两途径中的关键酶分别为 ADC 和 ODC遥
合成的 Put 与来自脱羧 S- 腺苷甲硫氨酸渊dSAM冤
的 氨 丙 基 在 亚 精 胺 合 酶 渊SPDS冤尧 精 胺 合 酶
渊SPMS冤的作用下进一步合成 Spd 或 Spm[3]遥 Put
蛋白等生物大分子的构象袁 并调控核酸的复制尧
转录和翻译袁 与肉桂酸等结合形成 HCAAs渊Hy-
droxycinnamic acid amides冤等次生代谢物质参与
植物对真菌尧病毒等非生物胁迫响应[4]遥 此外袁多
胺分解代谢产物 H2O2尧氨基丁酸渊GABA冤等也是
植物胁迫响应过程的重要产物袁 其中 H2O2 不仅
摘要院以抑制性消减杂交渊SSH冤文库序列为基础袁采用生物信息学和 RT-PCR 方法从陆地棉中克隆出精氨酸
脱羧酶基因袁命名为
1袁GenBank 登录号为 KC851856遥 该基因全长 2954 bp袁其中 5' 非翻译区 477 bp袁
具有多个参与胁迫响应的顺式作用元件和一个编码 8 个氨基酸的微型编码序列 渊uORF冤曰 主编码区渊mORF冤
thermore, the expression of
1 was rapidly up-regulated in the roots of the resistant variety by infection with
, while the tolerant variety did not show remarkable changes in its expression after infection. This indicated that the gene
cDNA of
1 was 2954-bp long. The 5' UTR was 477-bp and contained several -acting elements involved in stress re-
sponses and a uORF encoding an 8-amino acid sequence. The main ORF was 2181-bp long, and encoded 726 amino acids with
基因对生物胁迫响应规律的研究相对较少[11]遥 目
前袁尚未见棉花中
参与黄萎病菌渊
Kleb.冤胁迫响应的实验证据遥本研究基
于构建的陆地棉抗黄萎病品种 SSH 文库[2]袁利用
生物信息学和 RT-PCR 技术袁在棉花中克隆出与
拟南芥等
基因具有较高同源性的 cDNA 序
列并命名为
1袁以两个对黄萎病抗性不同
probably involved in the early defense responses to
in the roots of the resistant cotton variety.
polyamine;
e; gene expression
黄萎病是影响棉花高产尧 稳产的重要因素袁 如何有效防治棉花黄萎病一直是生产中亟待解 决的问题遥 棉花抗病品种改良与应用是防治黄萎
病最经济有效的措施遥 揭示棉花抗病分子机理并 克隆与抗病性相关的重要功能基因对于抗病育 种具有重要意义[1-2]遥
收稿日期院2013-02-20 作者简介院李亚栋渊1983-冤男袁博士袁lyd-rain@126.com曰* 通信作者袁孙艳香袁yx_sun70@163.com曰马峙英袁mzhy@hebau.edu.cn 基金项目院973 前期研究专项 (2011CB111609)