重组克隆的筛选与鉴定

1. 原理
在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如 BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及 四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组 pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性， 但对四环素的抗性消失（敏感）。
2. 筛选的方法
①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培 养基上，并培养至菌落出现。
以Klenow片段标记3’末端为例说明末端 标记的方法。
4. 寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单 个核苷酸的点突变。
常用的寡核苷酸探针主要有两种: 单一已知序列的寡核苷酸探针 许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷
由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别， 它在生色底物X-gal 存在下，被IPTG 诱导，形成蓝色菌落。
当外源DNA片段插入到pBS 质粒的多克 隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋 白失活，产生的肽段失去α-互补能力。 因此，在同样条件下，含重组质粒的转
化子，在生色诱导培养基上，只能形成 白色菌落。
2. lacZ 基因的插入失活
pBS质粒上带有β-半乳糖苷酶基因的调 控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基 酸的编码序列。该编码区有一个多克隆 位点，但并不破坏lacZ 的阅读框架，不 影响其正常功能。
3. DH5α菌株
E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶的C 端的部分编码序列。
1. 双链DNA探针
双链DNA探针的合成方法 主要有两种： ①切口平移法。 ②随机引物合成法。
2. 单链DNA探针
单链DNA探针主要有两种合成方法: ①以M13载体衍生序列为模板，用
Klenow片段合成单链探针。 ②以RNA为模板，用反转录酶合成单链
cDNA探针。
3. 末端标记DNA探针
分子杂交就是将一种核酸单链用同位素 或非同位素标记成为探针，再与另一种 核酸单链进行杂交。
4. 探针
经过同位素或非同位素标记的已知序列 的寡核苷酸。
单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与 它们的目的序列配对，可以准确地设计 杂交条件，以保证探针只与目的序列杂 交而不与序列相近的非完全配对序列杂 交，对于一些未知序列的目的片段则无 效。
该技术已广泛应用于基因的表达、基因 定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制 作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病的诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交的基础
1. 变性与退火 DNA以双链形式存在，在进行分子杂交
时，先将双链DNA分子解聚为单链，这 一过程称为变性。
两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的 双链区的过程称为退火或复性。
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
3. 分子杂交法
分子杂交是通过一定方法，将核酸分子 固定在固相支持物上，然后用放射性标 记的探针与被固定的核酸分子杂交，经 显影后，显示出目的DNA或RNA所处 的位置。
重组克隆
无环丝氨酸
（2）氨苄青霉素抗性插入失活
氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺 酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青 霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪 色。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青 霉素指示液褪色---呈蓝灰色。据此选择 阳性克隆。
图 氨苄青霉素抗性插入失活
5. 选择培养的原理
在含有X-gal 和IPTG 的选择培养基上， 载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌 落，而携带插入片段的重组质粒转化子 为白色菌落。
平板37℃培养后，放于冰箱3-4 小时， 可使显色反应充分，菌落为蓝色。
图 -半乳糖苷酶显色反应
*
乳糖 X-gal
-半乳 糖苷酶
+ 半乳糖
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 和鉴定目的序列克隆。
常用的方法：将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
5. 杂交的灵敏度和特异性
核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异 性。
可以根据所使用的探针的已知序列，进 行特异性的靶序列检测。
二、探针的类型
根据核酸的性质，可分为： DNA探针、RNA探针、 cDNA探针和寡核酸
探针。 根据是否使用放射性标记物，可分为： 放射性标记探针和非放射性标记探针。 根据是否存在互补链，可分为： 单链和双链探针。 根据放射性标记物掺入情况，可分为： 均匀标记和末端标记探针。
第七章 重组克隆的筛选和鉴定
内容提要
第一节 载体表型选择法 第二节 DNA电泳检测法 第三节 核酸杂交检测法
第四节 免疫化学检测法 第五节 转译筛选法 第六节 真核重组基因的选择方法
一般克隆与筛选策略
第一节 载体表型选择法
根据载体提供的表型进行选择的方法： 抗生素抗性基因的插入失活选择法 -半乳糖苷酶的显色反应选择法
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。
④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培 养基上去找那些原始的克隆。
⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就 是含有重组pBR322质粒的重组子。
图 pBR322的结构图
在各自独立的情况下，pBS 和DH5α编 码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。 但在pBS 和DH5α融为一体时，可形成 具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。
4. α-互补现象
lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变 体与带有完整的近操纵基因区段的β-半 乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现 象。
（1）IPTG作用 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导
lacZ 基因的表达-半乳糖苷酶。 （2）X-gal作用 5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作为-半乳
糖苷酶水解的底物。
（3）X-gal的显色反应 β-半乳糖苷酶 (四聚体)将X-gal水解成半乳糖
苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝) 。在4℃蓝色加 深。
葡萄糖
+ 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
蓝色
图 LacZ 插入外源DNA
图 白色菌落与蓝色菌落的挑选
四、pBS重组质粒的筛选实验
使用的载体为pBS质粒。 转化受体菌为E. coli DH5α菌株。 由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因，故
重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互 补现象筛选相结合的方法。
pUC18/19的结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因：编码-半乳糖苷酶的部分
肽段。 Lac Z上有插入外源DNA的MCS位点。
4. 筛选的方法：蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培 养基，能合成-半乳糖苷酶。
α互补作用/现象
当pUC质粒转化LacZ基因的氨基未端 编码序列缺失的Lac- 指示菌株时，能恢 复β-半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG 和X-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4氯靛蓝，出现蓝色菌落的现象。
当外源DNA插入pUC的MCS时，α-互 补作用被破坏，在IPTG和X-gal平板上 则不显蓝色而出现白色菌落。
3. 抗菌素标记的选择
（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因 产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉
酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）褪色。 Ampr有Pst I、Sca I等多个插入位点。 （2）四环素 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （3）环丝氨酸 杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。
第三节 DNA电泳检测法
PFGE
一、直接电泳检测法
从转化后的克隆（转化子）中快速抽提 重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子 量大小。
插入外源DNA的重组质粒分子量大，没 有插入外源DNA的质粒分子量小。
比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移 快慢不同，即可选出重组子。
图 琼脂糖凝胶电泳图谱的比较
图 表型筛选加酶切筛选

０
A
A
T T
TA AT
三、PCR扩增检测法
1. 原理 在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用插入的DNA片段的引物作PCR。 （3）PCR产物电泳检查。 （4）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
第四节 核酸的分子杂交
3. -互补作用
-互补作用是pUC质粒载体的特性。 pUC载体：含有Lac Z基因，编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（ 片段，氨基端） 。 受体菌：基因组中带有突变的-半乳糖苷酶
基因（缺失片段），可被IPTG诱导表达 （只编码-半乳糖苷酶的-肽）。
载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸 收了带有LacZ基因的 pUC质粒，才能合成 完整的有活性的-半乳糖苷酶。
Marker 重组 载体
已知
未知
二、酶切产物电泳筛选法
1. 原理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切
图谱，选择1~2种内切酶切割质粒，电 泳后比较DNA来自百度文库数和长度。
或用一种内切酶切下插入片段，再用另 一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者 是否符合预计的结果。
图 酶切产物的电泳筛选
图 限制性内切酶酶切图谱
一、插入失活法的原理
一般原理
一种利用抗生素抗性基因或其他基因的 插入失活，来筛选重组子的方法。
通常外源DNA插入的位点设计在特定基 因上，一旦外源DNA插入，该基因就被 破坏而失去活性。由此来判断载体上是 否带有外源DNA。
二、利用抗生素抗性基因：pBR322
以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的 插入失活的原理。
载体
α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如pUC、pGEM系列载体。
菌株
α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如DH5α(LacZ△M15)、 JM101~110(LacZ△M15)等。
1. 抗性筛选
因pBS质粒带有Ampr 基因，而外源 DNA片段上不带该基因，故转化受体菌 后，只有带有pBS DNA 的转化子，才 能在含有Amp 的LB 平板上存活下来； 而只带有自身环化的外源DNA片段的转 化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
4. 选择的过程
（1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环
素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨 酸的平板，选择重组克隆。
Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环 素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常 生长，但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
三、利用-半乳糖苷酶显色
选择重组子的原理 1. -半乳糖苷酶与Lac Z基因 由E.coli lac操纵子上的Lac Z基因编码。
分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。 2. Lac Z基因 突变的Lac Z基因，只编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（氨基端） 。
2. 培养基中IPTG、X-gal 的作用
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。