植物基因克隆实验总结

2015-2016第二学期生物科学实验

（植物基因克隆）实验总结

班级：13级生物科学2班学号：1312022005 姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法：

实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺

序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。

通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。

实验方法及过程：

1. CTAB法提取水稻基因组DNA

配制CTAB溶液：

(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：

（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）

2. 配置琼脂糖缓冲液：

10×TBE Buffer配制方法：

每组需要：称量下列试剂，置于1 L烧杯中

Tris：108 g

Na2EDTA·2H2O：7.44 g

硼酸：55 g

向烧杯中加入约800 ml的无菌水，充分搅拌溶解。

加无菌水将溶液定容至1 L后，室温保存。用时稀释。

3. 开发设计引物

LOC_Os02g42310

Chromosome 2: 25,442,875-25,450,093

OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressed

Oryza sativa Japonica

GCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAA Oryza sativa Indica

GCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAA

Oryza sativa Japonica

GCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAA TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA T Oryza sativa Indica

GCGCCGGAGACGAAGA-----------------A TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA T

OLIGO start len tm gc%any3'seq

LEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTC

RIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTT

Length：201 japonica, 193 Indica

4. PCR反应体系

10×扩增缓冲液：每管：2 ul 共需：24ul

dNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6ul

模板DNA ：每管3 ul，共需36ul

Taq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul

引物1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。两种引物各6管。引物1、2代表的体系分别加灭菌水71.4ul 至120 ul，分装6个ep管。

5. PCR反应程序

95℃预加热5分钟，

95℃30秒钟

56℃30秒钟35循环

72℃30秒钟

72℃10分钟

16℃5分钟

总时长：1小时35分钟

6.琼脂糖凝胶电泳

制胶：称取1.6g琼脂糖于配好的160mlCTAB溶液（稀释10倍后的）中，在微波炉中加热溶解，冷却后，加入3ul的核酸染色剂（BE）。

倒胶：插入梳子，摇匀之后倒胶（1LTBE缓冲液，淹没琼脂），避光静置大概20min。

点胶：垂直拔掉梳子，把凝好的胶取出来放在有与制胶同浓度TBE缓冲液的电泳槽中。在第一个胶孔中加入maker，作对比。

上样：取2ulLoadingBffuer（一种沉淀剂，使点胶后样品沉到胶孔底部不浮上来）混匀10ul的DNA样品。用移液枪打入胶孔。

电泳：电压电流(100V、100mA)跑40min。

7．紫外灯下观察条带

条带清晰一段说明含DNA多。

8. 切胶回收

（1）切胶，然后加入胶的三倍体积的Buffer GA（若小于300bp ，按1：5）本组切下的三份胶均为0.15g，分别加入了450ul的Buffer GA

（2）55度水浴10分钟，期间摇晃2~3次

（3）加入200ul Buffer BL于离心柱，12000rpm离心30秒，弃上清

（4）将第2步得到的溶液中加到离心柱中，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清

（5）往离心柱加入500ul的rash Buffer ，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清。

（6）重复（5）

（7）12000rpm 离心1分钟（空管离心去乙醇）

（8）将离心柱转移到一干净的1.5毫升离心管中，保持离心管开放状态5~10分钟（挥发乙醇）

（9）加20~60ul的Elution(洗脱液)，65度预热，静置2分钟

(10)12000rpm离心2分钟，保存在-20度冰箱