高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的选育

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2008No 116

Se ri a lNo 1193

Chi na B rew i ng

Research Report

高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的选育

屈二军,张红波,赵　桢,陈兰英,谷令彪

(平顶山工学院生物工程系,河南平顶山467044)

摘　要:利用紫外线诱变出发菌株S1并筛选出高产纤维素酶的菌株NS1。结果表明:诱变菌株NS1在28℃培养48h,酶活达15104U /mL,分泌的纤维素酶活力比出发菌株S1提高1151倍。关　键　词:纤维素酶;枯草芽孢杆菌;紫外线

中图分类号:Q 81315 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2008)16-0038-02

Screen i n g and breed i n g of a h i gh cellul a se produc i n g stra i n Bac illus subtilis

QU Erjun,Z HANG Hongbo,Z HAO Zhen,CHE N Lanying,G U L ingbiao

(B ioengineering D epart m ent,Pingdingshan Institute of Technology,Pingdingshan 467044,China )

Abstract:U ltraviolet ray (UV )was used to induce mutati on on S1and a new Bacillus subtilis NS1with high yield of cellulase has been selected 1The cellu 2lase yield of NS1was 1151ti m es than that of S1and the yield of cellulase reached the highest when they were cultivated 48hours 1NS1from induced muta 2ti on had better capacity of p r oducing cellulase,which p r ovided a theoretic base for natural cellulose decomposition 1Key words:cellul ose;Bacillus subtilis;ultraviolet ray

收稿日期:2007204215

作者简介:屈二军(19752),男,讲师,研究方向为分子细胞生物学。

纤维素是地球上最为丰富的可再生性资源,占地球生物总量的40%,它同时是植物纤维的主要成分,占其干重的

30%～50%,是目前分布最广的天然碳水化合物,每年全球产量高达4000亿t [1]

。纤维素通过降解,可转化为人类急需的能源、食物、化工原料,对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义

[2]

。因此利用微生物所分泌

的纤维素酶对纤维素降解是一条既高效又环保的途径[3]。

纤维素酶广泛存在于动植物和微生物体内是不争的事实[4]

,

目前已分离筛选了多种产纤维素酶的微生物

[527]

,其中以真菌产纤维素酶研究居多,但鉴于细菌繁殖快,发酵周期短,有利于工业生产[8]

。此外,由于细菌所产生的纤维素酶一般最适

pH 值为中性至偏碱性,因而随着中性纤维素酶和碱性纤维

素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值[9]

。本研究以实验室保存的枯草芽孢杆菌S1为出发菌株,通过紫外线诱变并筛选高产纤维素酶的菌株。1材料和方法111材料

11111出发菌株和培养基

出发菌株(S1):采用本实验室保存的枯草芽孢杆菌。同时制备牛肉高蛋白胨培养基、纤维素刚果红培养基[9]

、基

础产酶培养基

[10]

,DNS 试剂

[11]

。

112方法

11211菌悬液的制备

枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基活化3代。取玻璃珠20～30粒放入250mL 三角瓶中,加入0185%生理盐水灭菌。挑取活化的出发菌株,接入三角瓶28℃振荡1h 成菌

悬液并调整其浓度约为103个/mL ～104

个/mL 左右。

11212紫外线诱变

紫外灯预热10min 后取15mL 菌悬液在无菌培养皿中并放于离紫外灯30c m 处磁力搅拌器上,诱变时间分别

0min 、1min 、5min 、10min 、15min 、20min 。照射处理后的菌悬

液在黑暗中存放1h,后在红光下将菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。

11213纤维素刚果红培养基平板筛选

选取致死率为90%左右的处理中生长良好的菌株分别点种在纤维素刚果红平板上,28℃培养72h,观察测定透明圈直径的大小和菌落直径的大小。选取二者比值较大者

NS1进一步检测。11214粗酶液的制备

在基础产酶培养基接入NS1菌液于30℃下恒温培养。取上述培养基5g,加水50mL,于30℃保温1h,用砂芯漏斗过滤,4500r/min 离心10min,提取上清液定容至100mL,得到1∶20的粗酶液。

11215葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线的绘制参照参考文献[3]进行。

11216酶活力的测定

在一定的反应条件下,每分钟由底物生成1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U )。计算公式为:

酶活力(U /mL )=[葡萄糖含量(mg )×稀释倍数×5156]/[应液

中酶液加入量(mL )×反应时间(m in )]

式中:系数5156表示1mg 葡萄糖的μmol 数。

2结果与讨论