神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值

神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统
的价值
陈京;余伟华;李付贵
【摘要】BACKGROUND:Neural stem cells, as a hot topic in neuroscience research, have a wide application prospect in the treatment of neurological damage, but how to obtain a large number of terminally differentiated and purified nerve cells with homogeneous features is a difficult problem in this field. The use of intracellular fluorescence reporter system to track the process of neural stem cell differentiation and obtain a single kind of terminally differentiated and purified nerve cells provides a viable option. OBJECTIVE: To explore the value of GFAP promoter-driven fluorescence reporter system in tracing the neural differentiation of neural stem cells (NSCs). METHODS: Cerebral cortex of mouse embryos were primarily dissociated and sent for digesting and pipetting mechanically before suspension culture, followed by immunofluorescence staining of Nestin to identify their biological characteristics. Lentivirus carrying pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato vector was employed to infect above-mentioned NSCs, and Geneticin (G418) was used to obtain purified NSCs at 14 days. Subsequently the purified cells were induced to differentiate into astrocyte-like cells; meanwhile red fluorescence changes in cells were observed by microscopy. The red fluorescent cells were then subjected to perform immunofluorescence staining at 13 days after induction. RESULTS AND CONCLUSION:The expression of Nestin in the isolated primary cells
was strongly positive. Purified NSCs were obtained by lentivirus infection and subsequent G418 resistance selection at 14 days. After induced into astrocyte-like cells, the red fluorescence was observed in the cells under the microscope and furthermore, GFAP staining was also positive. Mouse NSCs carrying neo-GFAP(promoter)-dTomato were successfully obtained. The cells could express dTomato under the control of GFAP promoter, which provides a powerful tool for research on NSC differentiation mechanism, neural transplantation and tissue engineering product development.%背景:神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点,在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景,但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点.利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程,并获得纯化的单一类型终末神经细胞为这一难点的解决提供了可行的方案.目的:探讨携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子驱动的荧光报告系统在神经干细胞神经分化示踪中的价值.方法:原代分离小鼠胚胎的脑部皮质,经机械消化和吹打后悬浮培养,免疫荧光染色检测其特异标志物Nestin的表达以确定神经干细胞.再将携带pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的慢病毒感染小鼠神经干细胞,遗传霉素G418筛选14 d后获得纯化神经干细胞,然后诱导其向星形胶质细胞分化,显微镜观察细胞红色荧光(dTomato)的变化.诱导第13天采用细胞免疫荧光技术对表达红色荧光的细胞行GFAP抗体复染.结果与结论:①原代分离获得的小鼠神经干细胞呈Nestin表达阳性;②慢病毒感染并筛选14 d后得到具有G418抗性的纯化神经干细胞;③该细胞经神经诱导分化后,显微镜下观察到红色荧光大量表达,且GFAP复染与红色荧光具有非常高的一致性;④实验成功地获得了体外表达neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的小鼠神经干细胞,该细胞可以体外示踪GFAP
基因的特异表达,为神经干细胞的定向神经分化机制、细胞移植及组织工程产品开
发等研究提供了有力的工具.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2017(021)021
【总页数】6页(P3370-3375)
【关键词】干细胞;分化;神经干细胞;慢病毒;红色荧光蛋白;胶质纤维酸性蛋白;广东
省自然科学基金
【作者】陈京;余伟华;李付贵
【作者单位】中山大学附属中山医院肿瘤研究所,广东省中山市 528403;中山大学
附属中山医院分子诊断中心,广东省中山市 528403;中山大学干细胞与组织工程研
究中心,广东省广州市 510080;中山大学附属中山医院肿瘤研究所,广东省中山市528403
【正文语种】中文
【中图分类】R394.2
0 引言 Introduction
神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一种主要起源于侧脑室和海马齿状回的
成体干细胞，具有自我更新、多向分化等潜能[1-2]，近年来的研究进展预示了未
来它在修复神经损伤、筛选神经药物及阐明神经发育机制等方面的重要作用[3-6]。

利用终末分化神经细胞特异标志物的启动子序列耦联荧光报告基因构建表达载体导入神经干细胞，该启动子的激活能够引起荧光报告基因的表达而产生荧光信号，通
过观察荧光的表达就可以动态观察和追踪神经干细胞定向分化过程中相关标志物的表达，不仅有助于筛选促进神经干细胞定向神经分化的小分子化合物以及具有神经发育毒性的药物，而且可以通过抗性筛选获得特定的神经类细胞，用于神经组织或细胞损伤的修复[7-10]。

实验将携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子和荧光报告基因dTomato的慢病毒载体转导神经干细胞，并诱导其向星形胶质细胞分化，为监控神经干细胞分化过程、体内外示踪和GFAP基因功能等研究提供基础数据。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8月至2016年7月在中山大学干细胞与组织工程研究中心实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 实验动物 C57/BL6小鼠1只，孕1
2.5 d，SPF级，4月龄，体质量约30 g，由中山大学实验动物中心提供。

实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.3.2 试剂和仪器慢病毒包装系统(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(Hyclone公司)；
谷氨酰胺(L-glutamine)、氨苄青霉素、链霉素、G418、多聚赖氨酸、二甲基亚砜、核染料DAPI(Sigma公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco公司)；DMEM/F12、B27、肝素、非必需氨基酸(NEAA)、NeurobasalTM、0.25%胰酶(TrypLE Select)(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；羊抗鼠nestin(Abcam公司)；兔抗鼠GFAP(Dako公司)；二抗Cy3羊抗兔IgG、二抗Cy3兔抗羊IgG(CST公司)；CO2培养箱(Thermo公司)；超高速冷冻离心机(Beckman公司)；荧光显微镜BX51(Olympus公司)。

1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的分离培养
取原代神经干细胞进行悬浮培养[11-12]：取孕12.5 d的母鼠断颈处死，然后用体积分数为75%乙醇消毒腹部，剖开腹部取出含有胚胎的子宫，置于消毒过的玻璃
皿中，PBS冲洗。

在体视显微镜下剥离子宫和羊膜，取出胚胎，剥离胎膜，分离出胎脑皮质，放入离心管中，加入2mL神经干细胞悬浮培养液(DMEM/F-12培养基加入B27(1∶50)，5mg/L肝素，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮生长因子，100
U/mL青霉素和100mg/L链霉素)，用细吸管吹打成单细胞悬液，接种到25 cm2培养瓶中，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中。

单层培养[13-14]：将悬浮培养的神经干细胞及培养液吸至15mL无菌离心管，1 100 r/min离心4min去除上清，加入0.25%胰酶和PBS，吹打成单细胞悬液，
加入约8mL PBS终止，再以1 100 r/min离心4min去除上清，用神经干细胞单层培养液(100mL NeurobasalTM培养基中加入B27(1∶50)，250 μLL-Glutamine，100 U/mL青霉素和100mg/L链霉素，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)重悬，接种于包被0.1%多聚赖氨酸的6孔板，隔天换液，每3 d或4 d
传代1次。

1.4.2 神经干细胞的鉴定采用细胞免疫荧光化学法检测传代后培养两三天的神经干细胞。

首先用0.01mmol/L PBS洗涤细胞2次，10min/次，用40 g/L多聚甲醛
固定细胞20min；再以0.01mmol/L PBS洗涤细胞3次，10min/次，室温下用0.01mmol/L PBS和0.2%Triton X-100穿透胞膜30min；体积分数为0.3%-0.5%山羊血清封闭30min。

加入一抗后4℃过夜孵育。

第2天，用0.1mmol/L PBS洗涤3次，10min/次。

二抗室温孵育0.5-1.0 h。

0.1mmol/L PBS洗涤3次，
10min/次。

用1mg/L DAPI复染细胞核。

荧光显微镜下观察拍照。

一抗为羊抗鼠nestin，所用比例为1∶500。

二抗为Cy3兔抗羊IgG，所用比例为1∶100。

1.4.3 慢病毒的包装中山大学干细胞与组织工程研究中心采用gateway技术构建
并提供实验所需的携带组织特异启动子驱动荧光报告基因的慢病毒载体
(pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato)[15-16]。

慢病毒的包装和浓缩：将上述慢病毒载体和慢病毒的包装质粒ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix各4.5mg采用脂质体Lipofectamine 2000共转入293FT细胞，进行慢病毒的包装[17-19]。

48-72 h后将含病毒的上清液收集至15mL离心管，4℃、3 000 r/min条件下离心15min，0.22 μm滤器过滤去除细胞碎片。

再以4℃、100 000 r/min离心2 h，然后浓缩病毒，分装后存储于-80℃低温冰箱。

1.4.4 慢病毒感染神经干细胞选取传代后贴壁培养的神经干细胞，换液时先加入1mL 37℃预热的神经干细胞单层培养液，再加入浓缩分装的病毒悬液20 μL，置于37℃、体积分数为5%CO2的培养箱。

8 h后将上述培养液换更为神经干细胞单层培养液。

第2天重复上述步骤。

连续感染3次后，采用神经干细胞单层培养液继续培养。

每次实验结果均重复3次。

1.4.5 神经干细胞的纯化连续感染神经干细胞3次后，观察细胞生长状态。

待细胞状态较好时，采用300mg/L遗传霉素G418开始筛选，连续筛选14 d[20]。

1.4.6 纯化后神经干细胞的神经诱导分化及其鉴定采用去除生长因子(表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)的神经干细胞悬浮培养液对转导后纯化的神经干细胞进行神经诱导。

每天观察细胞内红色荧光表达的强弱及数量的变化。

再按照上述1.4.2步骤对红色荧光细胞进行免疫荧光鉴定和分析。

一抗为兔抗鼠GFAP，所用比例为1∶500。

二抗为Cy3羊抗兔IgG，所用比例均为1∶200。

1.5 主要观察指标①原代小鼠神经干细胞的形态；②小鼠神经干细胞表面标记物的表达；③慢病毒的包装和感染；④筛选和纯化后的荧光细胞的鉴定。

2 结果 Results
2.1 神经干细胞的形态学观察与鉴定结果原代分离的小鼠胎脑皮质细胞在神经干
细胞悬浮培养液中培养24 h，细胞悬浮生长，部分聚集成团块状，团块周边细胞折光性好。

48 h后形成立体感强、折光性好且形态规则的细胞球，即神经球(Neurosphere)(图1A)[21-22]。

用0.25%胰酶消化神经球，辅以机械吹打制成单细胞悬液，接种于包被0.1%多聚赖氨酸的6孔板。

采用神经干细胞单层培养液培养，24 h后可观察到贴壁细胞边缘向外伸出发丝状突起，与邻近细胞发出的突起相互连接，交织成网状(图1B)。

细胞免疫化学法鉴定可见贴壁细胞呈Nestin染色强阳性，胞浆部位着色而胞核不着色，证实贴壁培养的细胞为神经干细胞(图2)[23]。

2.2 慢病毒的成功包装贴壁培养的293FT细胞密度达到90%左右时，更换无抗生素培养基，再以载体质粒和包装质粒共转染8 h，之后用新鲜培养基换液。

72 h 后，镜下观察到大量293FT细胞发生融合，形成多核复合体并表达强红色荧光(图3)，提示慢病毒包装成功。

2.3 慢病毒转导神经干细胞及其纯化浓缩后的慢病毒以1×1010L-1的滴度连续感染神经干细胞3次，3 d后观察到细胞生长状态稍差，部分细胞出现死亡，6-8 d 后可见细胞生长状态逐渐转好并开始大量增殖。

随后采用G418连续筛选14 d，获得慢病毒载体稳定表达的神经干细胞阳性细胞株。

该细胞株经传代后，显微镜下仅见个别细胞有弱红色荧光表达(图4)。

2.4 慢病毒感染神经干细胞后纯化细胞的神经分化及对荧光细胞的鉴定结果转导pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato载体后的神经干细胞向星形胶质细胞分化过程中，镜下观察可见细胞发生一系列的变化。

采用去除生长因子(表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)的神经干细胞培养液进行培养后，随着时间延长观察到表达红色荧光的细胞数目开始增多，荧光强度大幅增强(图5 A)；荧光表达的高峰期在神经分化的第9-13天(图5B)。

在分化的第13天，利用免疫荧光染色法对表达红色荧光的分化细胞进行GFAP抗
体复染，结果发现红色荧光与GFAP的绿色荧光染色的位置保持高度的一致(图6)。

此结果证明，慢病毒载体转导后的神经干细胞，经过神经分化后获得的表达红色荧光的细胞就是星形胶质细胞。

这一体系的成功建立，为后续的神经干细胞定向分化及GFAP的功能研究等提供了非常好的细胞工具。

图1 原代分离培养的神经干细胞显微镜图片(Bar=100 μm)Figure 1 Microscope images showing morphology of primary neural stem cells(scale bar=100
μm)图注：图中A为悬浮培养的神经球；B为单层培养后，贴壁细胞呈长梭形，边缘可见丝状突起。

图2 免疫荧光检测原代神经干细胞的Nestin表达(Bar=100 μm)Figure 2 Nestin immunofluorescence detection of primary neural stem cells(scale bar=100 μm)图注：图中A为Nestin抗体；B为DAPI核染色；C为荧光融合图片。

图3 慢病毒包装情况(Bar=100 μm)Figure 3 Lentivirus packaging(scale
bar=100 μm)图注：图中A显示白光下观察到293FT细胞发生融合，形成多核复合体；B显示荧光显微镜下观察到多核复合体呈红色表达，提示病毒包装成功。

图4 神经干细胞阳性细胞株传代后形态(Bar=100 μm)Figure 4 Morphology of neural stem cells with G418 resistance after subculture(scale bar=100 μm)
图注：图中A为白光下观察图片，贴壁细胞仍呈梭形，细胞间丝状突起交互连接；B为荧光显微镜下观察图片，仅有个别细胞见弱红色荧光表达。

图5 神经诱导分化后红色荧光变化(Bar=100 μm)Figure 5 Changes of red fluorescence after neural induction and differentiation(scale bar=100 μm)
图注：图中A为诱导6 d的荧光表达；B为诱导13 d的荧光表达。

图6 转染pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的神经干细胞神经分
化鉴定(Bar=100 μm)F igure 6 Identification of differentiation of neural stem cells transfected with pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato
vector(scale bar=100 μm)图注：图中A为红色荧光表达；B为GFAP抗体复染；C为DAPI核染色；D为融合图。

3 讨论 Discussion
星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统的主要细胞类型之一[24-26]，其胞体呈星
形突起状，对神经元具有支持、营养和分隔等作用，也在组织损伤修复、宿主防御机制等过程当中起到重要的作用[27-29]。

当神经系统损伤时，星形胶质细胞大量
增殖且活性增强[30]。

GFAP是星形胶质细胞的细胞骨架成分和特异标志物[31]。

dTomato是一种来自水果蛋白的橙色衍生物，其分子结构具有一对发光基团，导致其亮度极强且光稳定性非常好，已广泛应用于多种组织和细胞的标记示踪[32-34]。

采用dTomato标记星形胶质细胞特异性标志物GFAP的启动子，不仅可以
可视化地监控神经干细胞神经分化的动态过程，而且对于诱导的星形胶质样细胞的分离纯化、移植修复及神经分化小分子药物筛选平台的建立等具有重要的应用前景。

研究的技术难点和重点是如何将上述荧光报告系统成功导入小鼠神经干细胞。

神经干细胞属于成体干细胞，难以采用线性化质粒DNA、脂质体包裹及电穿孔等方式转导基因片段，而病毒载体的感染效率则显著高于上述几种方法[35]。

目前大多数研究采用的病毒载体主要有腺病毒、反转录病毒和慢病毒等3种[36-38]。

携带外源基因片段的腺病毒无法整合至宿主染色体，因而无法获得稳定表达的细胞株。

而反转录病毒只能携带片段较小的外源基因，限制了其广泛使用。

以缺陷型HIV-1
病毒为基础发展起来的慢病毒载体，对各类细胞均具有非常强的感染能力，且可将外源基因片段随机整合至宿主细胞染色体，此外还具有能携带较大的外源基因片段的优点[39-40]。

在本实验中，将携带neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的慢病毒连续感染小鼠神经干细胞，随后以G418抗性筛选细胞14 d，最终获得存活
的细胞，表明该细胞中已成功表达含有G418抗性的上述载体。

随后在显微镜下
观察发现，该细胞群体中只有极少数已自发分化的细胞表达红色荧光，而大部分细
胞均未见荧光表达。

在小鼠神经干细胞神经分化诱导过程中，观察到细胞内的红色荧光表达由弱到强，逐渐增加。

为了对该荧光细胞的生物学特性进行鉴定，采用GFAP抗体进行复染，可以观察到红色荧光表达的细胞，与GFAP的表达部位高度重叠，证实所获得的
红色荧光细胞为星形胶质样细胞。

因此可以证明，该荧光报告系统能够成功地表达于小鼠神经干细胞，且并未引起其明显的自发分化。

向神经诱导分化过程中，dTomato荧光信号在细胞内逐步增强，该过程可视化地体外示踪和反映了GFAP
蛋白的表达水平。

实验成功建立了可评价神经干细胞向星形胶质细胞定向分化的荧光报告系统，并采用经典的神经诱导分化方案对该系统的可行性进行了初步验证。

该系统能够可视化地示踪和监控神经干细胞定向分化为星形胶质细胞的过程，对于筛选神经分化相关小分子化合物和修复神经损伤等都具有非常重要的意义。

实验不足之处是所获得的星形胶质样细胞并未能进行神经功能方面的鉴定和研究，因此这也成为下一步亟待开展和完善的工作。

作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者，实验实施为第一、二作者，论文撰写为第一作者，论文审校为通讯作者。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：研究用动物组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。

论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销
毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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