细胞超微结构与电镜技术：扫描电子显微镜
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2020年10月
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core 电子探针与样品的交互作用
•一束细聚焦的电子束轰 击样品表面时，入射电子 与样品的原子核和核外电 子将产生弹性或非弹性散 射作用，并激发出反映样 品形貌、结构和组成的各 种信息，如：二次电子、 背散射电子、阴极发光、 特征X 射线、俄歇过程和 俄歇电子、吸收电子、透 射电子等。
2020年10月
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core
2020年10月
7
core
扫描电镜的特点
2020年10月
8
core 观察表面形貌，富于立体感
• 电子束冲击样品，利用从样品表面发射的二次电 子成像，这样所观察的就不是样品的内部结构， 而是表面的特征。
2020年10月
9
core
景深长，立体感强
•“景深”是用以表达纵深方向层次细节程度的度 量，数值不固定，与放大倍数和分辨率有关。扫 描电镜景深大，图像立体感强。扫描电镜的景深 比光学显微镜大几百倍，比透射电镜大十倍左右 ，并且可不受样品大小和厚度的限制。
• 离子溅射法 真空镀膜法
• 扫描电镜观察
23
几种常见生物扫描电镜样品的取样准备
core
• 组织样本
• 血管腔、肺泡腔等，需将材料进行简单切割，保证腔面表面不受破坏 。样品基底部尽量切割平整，便于样品粘台
• 含水量少的样品
• 花粉、药粉：干燥后，均匀地粘贴在样品台上，直接喷金观察
• 头发、果壳：表面清洗干净，烘干，粘贴、喷金、观察
扫描电镜样品制作步骤
core
• 取材：样品（如血细胞、组织）面积小于样品台，样品编号。
• 清洗：清除样品表面的黏液、油脂、蜡质、杂质等
• 蒸馏水；超声波；蛋白水解酶；磷酸缓冲液、生理盐水；脂溶 剂；（不损伤样品表面细节）
• 固定：2.5%戊二醛、1％锇酸双固定 • 清洗：磷酸缓冲液 • 脱水及置换：乙醇、丙酮、醋酸异戊酯等 • 临界点干燥：临界点干燥仪 • 样品粘贴：样品台或载玻片上 • 金属镀膜：金、铂、金/铂（6/4）、铂/钯（7/3）、
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二次电子成像原理
core
• 入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子电离产生的电子，
称二次电子。习惯上把能量小于50eV电子统称为二次电子，仅在样品表 面5nm～10nm的深度内才能逸出表面
• 扫描电镜荧光屏上以亮度不同来反映物体表面的形貌。越亮，表面约突 出；越暗，越凹陷。
• 因此进入集电器的二次电子数量是样品表面特征和入射角的函数，图像 上的亮度也受上述二因素影响。在样品凸出的地方，以及面向集电器的 方向，所成图像较亮，反之则较暗。
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core 其他影响因素
• 原子序数的差异 •原子序数高的元素，二次电子发射强；反之原子序 数低的元素，二次电子发射弱。因此样品结构内元 素的不同，在图像上也会形成一定的亮度差异。
• 样品的边缘和尖端效应 •导电性能差的样品经常容易产生充、放电现像，以 及样品的电磁特性等也会造成二次电子发射数量上 的差异和对电子轨迹产生偏折的影响。
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core
•二次电子检测
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core
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core
扫描电镜生物样品制备技术
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•样品表面高低参差，凹凸不平，而电子束中各个电子以几乎平行方向打 击至样品表面，但在样品表面不同点上受电子作用力的角度不同，激发 出的二次电子量亦不同。
• 二次电子是由固定位置的集电器所收集，由于电子束至样品表面各点的 入射角不同，引起二次电子向空间散射的角度也不同，结果进入集电器 中二次电子的数量也有不同。
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core
• 电子显微镜 ：一种高精密度的电子光学仪器，用电 子束成像，具有较高分辨率和放大倍数，是观察和研究 物质微观结构的重要工具。 • 扫描电子显微镜（扫描电镜，SEM）：用极细的电子 束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探扫描 式测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显 示物体（细胞、组织等）表面的立体构像，可摄制成照 片。用于观察样品表面的形貌结构。
1
core
扫描电子显微镜
Scanning Electron Microscope（SEM）
2
core
• 引言 • 扫描电镜的特点 • 扫描电镜的基本结构与原理 • 扫描电镜的生物样品制备技术 • 扫描电镜图片
2020年10月
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core
引言
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core
• 不少工作要求能在保持自然形态的条件下，对样品表面 形态特征进行直接观察，如植物花粉、孢子、昆虫等，这 些观察要求电镜有较大的景深、较大的观察范围和简单的 样品制备过程或不经过任何处理立即进行观察，因此诞生 了扫描电镜。 • 1935年德国人Kholl提出了SEM的设计思想与工作原理 • 1942年英国剑桥大学在CW Oatley指导下制成世界上第 一台SEM
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core
可观察块状标本
• 由于扫描电镜是收集样品的二次电子进行成 像，样品放在物镜强磁场以外，因此可有足够 的空间来放置大块标本，标本体积一般可为 0.5~10cm3。
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core
样品制备简单
• 与透射电镜样品制备相比，制备过程较简单， 不需包埋、切片。有些样品含水分较少，干燥过 程不易变形时，可不经任何处理或简单喷镀金属 后即可放于扫描电镜下进行观察。
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core
放大范围广，分辨率高
• 光学显微镜的放大倍数一般为1～2000倍，最大分 辨率为0.1～1微米。
• 透射电镜的放大倍数为2或3千～100万倍，分辨率 为0.2～0.5纳米。
• 扫描电镜的放大倍数可从数十倍、直到十几万倍， 它的有效放大范围广，使用方便。这样既可在低倍时 观察一个蚊子的全貌，又能逐步放大后，不同程度的 观察其某些局部的细微结构。分辨率可达几个纳米。
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core
可结合元素分析
• 可结合能谱仪或波谱仪进行X射线显微分析， 这样可在观察形貌的同时逐点进行细胞结构的元 素分析，便于进行快速综合的研究。
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core
扫描电镜的基本结构和镜重要组成部分
• 形成电子探针的电子光学系统 • 探针的电子束打击样品表面形 成信息信号 • 检测系统 • 电子偏转系统
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core 电子探针与样品的交互作用
•一束细聚焦的电子束轰 击样品表面时，入射电子 与样品的原子核和核外电 子将产生弹性或非弹性散 射作用，并激发出反映样 品形貌、结构和组成的各 种信息，如：二次电子、 背散射电子、阴极发光、 特征X 射线、俄歇过程和 俄歇电子、吸收电子、透 射电子等。
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扫描电镜的特点
2020年10月
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core 观察表面形貌，富于立体感
• 电子束冲击样品，利用从样品表面发射的二次电 子成像，这样所观察的就不是样品的内部结构， 而是表面的特征。
2020年10月
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core
景深长，立体感强
•“景深”是用以表达纵深方向层次细节程度的度 量，数值不固定，与放大倍数和分辨率有关。扫 描电镜景深大，图像立体感强。扫描电镜的景深 比光学显微镜大几百倍，比透射电镜大十倍左右 ，并且可不受样品大小和厚度的限制。
• 离子溅射法 真空镀膜法
• 扫描电镜观察
23
几种常见生物扫描电镜样品的取样准备
core
• 组织样本
• 血管腔、肺泡腔等，需将材料进行简单切割，保证腔面表面不受破坏 。样品基底部尽量切割平整，便于样品粘台
• 含水量少的样品
• 花粉、药粉：干燥后，均匀地粘贴在样品台上，直接喷金观察
• 头发、果壳：表面清洗干净，烘干，粘贴、喷金、观察
扫描电镜样品制作步骤
core
• 取材：样品（如血细胞、组织）面积小于样品台，样品编号。
• 清洗：清除样品表面的黏液、油脂、蜡质、杂质等
• 蒸馏水；超声波；蛋白水解酶；磷酸缓冲液、生理盐水；脂溶 剂；（不损伤样品表面细节）
• 固定：2.5%戊二醛、1％锇酸双固定 • 清洗：磷酸缓冲液 • 脱水及置换：乙醇、丙酮、醋酸异戊酯等 • 临界点干燥：临界点干燥仪 • 样品粘贴：样品台或载玻片上 • 金属镀膜：金、铂、金/铂（6/4）、铂/钯（7/3）、
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二次电子成像原理
core
• 入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子电离产生的电子，
称二次电子。习惯上把能量小于50eV电子统称为二次电子，仅在样品表 面5nm～10nm的深度内才能逸出表面
• 扫描电镜荧光屏上以亮度不同来反映物体表面的形貌。越亮，表面约突 出；越暗，越凹陷。
• 因此进入集电器的二次电子数量是样品表面特征和入射角的函数，图像 上的亮度也受上述二因素影响。在样品凸出的地方，以及面向集电器的 方向，所成图像较亮，反之则较暗。
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core 其他影响因素
• 原子序数的差异 •原子序数高的元素，二次电子发射强；反之原子序 数低的元素，二次电子发射弱。因此样品结构内元 素的不同，在图像上也会形成一定的亮度差异。
• 样品的边缘和尖端效应 •导电性能差的样品经常容易产生充、放电现像，以 及样品的电磁特性等也会造成二次电子发射数量上 的差异和对电子轨迹产生偏折的影响。
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•二次电子检测
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扫描电镜生物样品制备技术
2020年10月
22
•样品表面高低参差，凹凸不平，而电子束中各个电子以几乎平行方向打 击至样品表面，但在样品表面不同点上受电子作用力的角度不同，激发 出的二次电子量亦不同。
• 二次电子是由固定位置的集电器所收集，由于电子束至样品表面各点的 入射角不同，引起二次电子向空间散射的角度也不同，结果进入集电器 中二次电子的数量也有不同。
2020年10月
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core
• 电子显微镜 ：一种高精密度的电子光学仪器，用电 子束成像，具有较高分辨率和放大倍数，是观察和研究 物质微观结构的重要工具。 • 扫描电子显微镜（扫描电镜，SEM）：用极细的电子 束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探扫描 式测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显 示物体（细胞、组织等）表面的立体构像，可摄制成照 片。用于观察样品表面的形貌结构。
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core
扫描电子显微镜
Scanning Electron Microscope（SEM）
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• 引言 • 扫描电镜的特点 • 扫描电镜的基本结构与原理 • 扫描电镜的生物样品制备技术 • 扫描电镜图片
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引言
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• 不少工作要求能在保持自然形态的条件下，对样品表面 形态特征进行直接观察，如植物花粉、孢子、昆虫等，这 些观察要求电镜有较大的景深、较大的观察范围和简单的 样品制备过程或不经过任何处理立即进行观察，因此诞生 了扫描电镜。 • 1935年德国人Kholl提出了SEM的设计思想与工作原理 • 1942年英国剑桥大学在CW Oatley指导下制成世界上第 一台SEM
2020年10月
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可观察块状标本
• 由于扫描电镜是收集样品的二次电子进行成 像，样品放在物镜强磁场以外，因此可有足够 的空间来放置大块标本，标本体积一般可为 0.5~10cm3。
2020年10月
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core
样品制备简单
• 与透射电镜样品制备相比，制备过程较简单， 不需包埋、切片。有些样品含水分较少，干燥过 程不易变形时，可不经任何处理或简单喷镀金属 后即可放于扫描电镜下进行观察。
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core
放大范围广，分辨率高
• 光学显微镜的放大倍数一般为1～2000倍，最大分 辨率为0.1～1微米。
• 透射电镜的放大倍数为2或3千～100万倍，分辨率 为0.2～0.5纳米。
• 扫描电镜的放大倍数可从数十倍、直到十几万倍， 它的有效放大范围广，使用方便。这样既可在低倍时 观察一个蚊子的全貌，又能逐步放大后，不同程度的 观察其某些局部的细微结构。分辨率可达几个纳米。
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core
可结合元素分析
• 可结合能谱仪或波谱仪进行X射线显微分析， 这样可在观察形貌的同时逐点进行细胞结构的元 素分析，便于进行快速综合的研究。
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扫描电镜的基本结构和镜重要组成部分
• 形成电子探针的电子光学系统 • 探针的电子束打击样品表面形 成信息信号 • 检测系统 • 电子偏转系统