绿色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选

( College of Plant P ro tectio n, S heny ang A gr icultur al Univ er sity , Sheny ang 110161, China)
Abstract Fiv e single and 7 mix ed so lid substr ates w ere prima rily screened according t o the spor ulatio n quantit y and spo re g erminatio n r ate of T r ichoder ma v ir ide iso late T R 8. As a r esult, three sing le substrates ( co rn g rain pieces, rice car apace and w heat br an) and one mix ed substrat e ( co rn g rain pieces + wheat br an + r ice carapace + urea) wer e achiev ed w ith the most spo rulat ion quantity and the hig hest spor e ger minatio n rate. Her ein the co rn g rain pieces, wheat bran, r ice car apace and urea wer e chosen as four com ponents w ith different weight lev els, and the or tho go nal desig n was tested. T he 6th prescription of all 9 ortho go nal pr escr iptio n substr ates w as selected as the best one w ith the hig hest spor ulatio n quantity o f 9. 90 1010 cfu/ g , three times higher than that of the best substrates se lected fr om the preliminary test s w itho ut o rthog onal desig n, and spo re g erminatio n rate of 95. 01% . Key words T r ichoder ma v ir ide; so lid substr ate fermentation; spor ulatio n quantity; spo re ger mination r ate
表 1 绿色木霉菌一般组 合固体培养基的发酵筛选1)
固体培养基组分
最低
产孢量/ 1010 个 g- 1
最高
平均 ∀ SE
麸皮+ 脲 稻壳+ 麸皮+ 脲
2. 812 5 2. 250 0
3. 375 0 2. 812 5
( 3. 187 5 ∀ 0. 328 4) a ( 2. 562 5 ∀ 0. 286 4) ab
绿色 木霉菌( T r ichoder ma vi ride ) 对植物病 原 真菌的拮抗作 用包括竞争作用、重寄生 作用、抗 生 作用、诱导抗 性、促进 生长等 多种 机制, 可 广泛 应 用于多种 蔬菜、花 卉、经济作 物等 多种 作物 上, 用 于防治立 枯丝 核菌、腐霉 菌、齐整 小核 菌、镰刀 菌 等引起的多种病害, 绿色木霉菌 T R 8 由沈 阳农业
大学植物保护学院 农药科学教研 室筛选开发并 通 过了生物学特性[ 1] 、拮抗机制[ 2] 及田间防效试验[ 3] 等方面的研究, 证明对土传病害具有较好的防治效 果。国 内 外 对 绿 色 木 霉 的 防 腐 作 用[ 4] 、防 病 作 用[ 5] 、作用机制[ 6] 及发酵 工艺进行 了大量研 究, 结 果表明脲为绿色木霉发酵的最优氮源[ 7- 8] , 绿色 木
9 种正交组合固 体培养基: 以 玉米碎粒、麸皮、 稻壳、脲为 4 个组分因子, 每个组分因子分别按不同 质量比例设 3 个水平, 9 种正交 配方 配制而 成( 表 1) 。
液体培养基: 为蔗糖、酵母培养液, 作为拌种固 体发酵的 2 级菌种培养液。 1. 3 固体发酵配方的正交设计
通过单一固体培养基发酵试验, 确定一般组合 固体发酵培养基组 分, 进行 初筛, 从 中选出玉 米碎 粒、麸皮、稻壳、脲为组分因子, 每个因子分别设不同 质量比例的 3 个水平, 以产孢量和孢子萌发率为标 准按正交设 计配制成 9 种配方进行 优化组合筛选 ( 表 1) 。
第 33 卷第 2 期( 2007)
研究报告
PLA N T PRO T ECT IO N V o l. 33 N o . 2 ( 2007)
61
[ J] . 资源开发与市场, 2004, 20( 5) : 325- 327. [ 12] 何 衍彪, 谷文 祥, 庞 雄飞 . 香 泽 兰 和苦 槛 蓝 中的 黄 酮 类提 取
上述各处 理经发酵培 养后, 用 0. 03% 吐 温 20 液洗脱和收集分生孢子, 分别进行分生孢子量和孢 子萌发率测定, 方法同前, 作为筛选指标。 1. 5 数据统计
试验结果统 计后, 用 SP SS 软件进行差异 显著 性分析和多重比较。
2 结果与分析
2. 1 固体发酵的初步筛选 绿色木霉菌在 5 种单一固体培养基发酵筛选的
表 1 固体发 酵正交组合试验设计( L943 )
配方序号
4 个因子1)
玉米碎粒
稻壳
麸皮
脲
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3Βιβλιοθήκη Baidu
2
2
3
9
3
3
1
1
1) 每个因子分别设不同质量比例的 3 个水平。
1. 4 发酵试验 1. 4. 1 液体发酵
将保存菌株经 PDA 培养基培养 4 d 后( 1 级菌 种) , 按 3% 接种量( 含分生孢子 5 107 个/ mL ) 接种 到 300 mL 三角瓶内, 每瓶装 100 mL 培养液, 3 个重 复。27 ! 无光照条件下、160 r/ min 摇床培养 48 h, 作为接种固体发酵培养基的 2 级菌种培养液备用。 用血球计数板计数孢子量, 用载玻片法、1% 酵母粉 培养液测定孢子萌发率, 5 个重复。 1. 4. 2 固体发酵
绿色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选
王英姿, 祁之秋, 魏松红, 程根武, 张 杨, 谷祖敏, 李兴海, 纪明山*
( 沈阳农业大 学植物保护学院, 沈阳 110161)
摘要 以测定绿色木霉菌产孢量和分生孢子萌发率为指 标, 分析 比较了 5 种 单一固体 培养基和 7 种一般组合 固体 培养基的发酵结果, 初筛出单 一培养基玉米碎粒、稻壳和麸皮以及一般组合培养基玉 米碎粒+ 麸皮+ 稻壳+ 脲为基 本培养基。在此基础上选取玉米碎粒、麸皮、稻壳、脲为 4 个组分因子进行不同配比的正交试验, 筛选出 6 号 为最佳 组合配方, 其分生孢 子量最高为 9. 90 1010 个/ g, 比初筛出的最佳 基本培养 基麸皮 + 脲( 3. 37 1010 个/ g ) 提 高约 3 倍, 孢子萌发率为 95. 01% 。
物对 小菜 蛾的 生 物 活性 [ J] . 热 带 农业 科 学, 20 03, 2 3( 6 ) : 19 - 2 5. [ 13] 凌 冰, 张茂新, 孔垂华, 等. 香泽 兰挥发油的化学 组成及其对植
物、真菌 和昆虫生长 的影响应 用[ J ] . 生态 学报, 2003, 14 ( 5) : 744- 746. [ 14] 冼继 东, 庞 雄飞 , 曾 玲. 异源 次 生化 合 物对 美 洲斑 潜蝇 种 群 控制 作用的 田间试 验[ J ] . 应 用 生态 学 报, 2 003 , 14 ( 1 ) : 9 7 - 1 00.
研究报告
霉对营养要求 不十分严格, 可利用纤维 素、半纤 维 素、几丁质等多种多 聚物作为碳源[ 9] , 但在普通 的 碳源培养液中孢子萌发不好, 而以 蜜二糖 为碳 源、 蛋白胨为氮源时孢子萌发率 最高[ 10 ] , 本 文旨在研 究以廉价的农副产品作为原料, 筛选出最佳的固 体培养基配方, 为绿色木霉菌的固体发酵研究提 供参考。
收稿日期: 2006- 08- 01
修订日期: 2006- 10- 15
基金项目: 辽宁省工程技术研究中心专项( 200535) ; 辽宁省自然科学基金( 002043)
* 通讯作者 T el: 024- 88492673
第 33 卷第 2 期( 2007)
62
PLA N T PR O TEC TIO N V ol. 33 N o. 2 ( 2007)
将单一固体培养基原料按一定比例装入 400 mL 烧杯中, 加入适量 水使湿度达到 100% , 灭菌, 自 然 冷却, 每杯接 2 级菌种培养液 2 mL( 含分生孢子 1
107 个/ mL ) , 搅拌均匀, 报纸封口, 3 个重复。在 27 ! 自然光照下 培养 3 d。同 法进行 7 种一般 组 合固体培养基发酵及 9 种正交组合配方的发酵 筛选。
玉米粒+ 麸皮+ 稻壳+ 脲
2. 062 5
2. 812 5
( 2. 437 5 ∀ 0. 375 0) ab
玉米粒+ 麸皮+ 脲
1. 500 0
2. 250 0
( 1. 812 5 ∀ 0. 390 3) bc
稻壳+ 脲 玉米碎粒+ 脲
0. 562 5 0. 562 5
1. 875 0 1. 125 0
关键词 绿色木霉菌; 固体发酵; 产孢量; 萌发率 中图分类号 S 476. 1
Orthogonal selection for optimized solid substrate fermentation of Trichoderma viride
Wang Ying zi, Q i Zhiqiu, W ei Songho ng , Cheng Genwu, Zhang Yang, G u Zumin, L i Xinghai, Ji M ing shan
基础上, 再进行一般组合初筛。结果表明单一固体 培养基发酵的产孢量以麸皮为最高, 其次为稻壳和 玉米碎粒, 分生孢子萌发率以稻壳为最高, 其次为麸 皮和玉米碎粒 ( 图 1) 。麸皮、稻壳和玉 米碎粒培养 基发酵 的绿 色 木霉 分 生孢 子 产量 依 次为 4. 86
图 1 木 霉菌单一固体发酵培养基筛选
因此选取麸皮、稻壳和玉米碎粒为基本组分, 经 7 种一般组合固体培养基发酵, 结果表明, 菌株的产 孢量以麸皮+ 脲最高, 其次为稻壳+ 麸皮+ 脲和稻
壳+ 玉米碎粒+ 麸皮+ 脲, 这 3 种一般组合培养基 的产孢量相接近, 平均在 2. 4 1010 ~ 3. 1 1010 个/ g 之间, 7 种一般组合培养基的分生孢子萌 发率除麸 皮+ 脲和玉米粒+ 麸皮+ 脲配方的孢子萌发率未达 到 90% 外, 其他配方的萌发率均较高, 在 92% 以上 ( 表 2) 。
第 33 卷第 2 期( 2007)
研究报告
PLA N T PRO T ECT IO N V o l. 33 N o . 2 ( 2007)
63
1010 、3. 06 1010 、2. 61 1010 个/ g, 孢子萌发率分别 为 95% 、89% 和 98% 。相比之下, 豆饼和稻草培养 基发酵的绿色木霉菌分生孢子产量和活力均较低。
1 材料和方法
1. 1 菌种 绿色木霉菌菌株 ( T R 8) 由沈阳农业大 学植物
保护学院农药科学实验室保存。
1. 2 发酵培养基 5 种单一固体培养基: 麸皮、黄豆饼粉、玉米碎
粒、稻壳、稻草, 均为廉价农副产品。 7 种一般组合固体培养基: 玉米碎粒+ 脲、稻壳
+ 脲、麸皮+ 脲、玉米碎粒+ 麸皮+ 脲、玉米碎粒+ 稻壳+ 脲、稻壳+ 麸皮+ 脲、玉米碎粒+ 麸皮+ 稻壳 + 脲, 按比例混合。