海金沙内生真菌多样性的研究

海金沙内生真菌多样性的研究

摘要：试验从海金沙的根、茎、叶器官中分离获得了内生真菌17株，鉴定出16株，另外1株因不产孢子而未被鉴定出，分别属于3个纲4个目5个科8个属。在鉴定的8属内生真菌中，以青霉属为优势属，占总株数的23.5%，其次是顶枝孢属和链格孢属，各占总株数的17.6%。表明海金沙不同部位、不同季节内生真菌的数量、分布、种群及其组成存在差异，体现了内生真菌生态分布的多样性。关键词：海金沙；内生真菌；多样性

中图分类号：q949.36+7.2；q948.12+2.3；q346+.5 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）04-0865-03

study on the diversity of endophytic fungi of lygodium japonicum

gan jin-lian，peng qin，zhan shou-fa，fan you-fu，chen ye （college of life science， jiujiang university， jiujiang 332000，jiangxi，china）

abstract： 17 strains of endophytic fungi were firstly isolated from root， stem and leaf tissues of lygodium japonicum （thunb.） sw.， of which 16 strains were identified belonging to 8 genera， 5 families， 4 orders， 3 classes；and one strain had not been identified owing to lack of spores. among the 8 genera of identified endophytic fungi，penicillium link ex fr. was the dominant genera， accounting

for 23.5% of the total number； the second were acremonium link and alternaria nees ex fr.， each of which was comprised 17.6% of the total number. quantity， distribution， and population constitution of endophytic fungi in l. japonicum varied in different tissues of the plants collected in different seasons， which reflected the ecological diversity of endophytic fungi in l. japonicum.

key words： lygodium japonicum （thunb.） sw.； endophytic fungi； diversity

植物内生真菌（endophytic fungi）是指那些经过长期协同进化，其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内，而且不会引起宿主产生可见病症的真菌。植物内生真菌与宿主植物在长期的生态系统演化过程中形成了互惠共生关系，内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质，既具有促进植物生长、增强抗病能力、提高抗逆性等作用，又具有医学上抗肿瘤、抗微生物等对人类有利的生物功效，因而在人们的生产与生活中具有重要的应用价值。

海金沙[lygodium japonicum（thunb.）sw.]系海金沙科（lygodiaceae）海金沙属（lygodium sw.）多年生蕨类植物，主产于广东、江苏、浙江、湖南、湖北、四川、陕西、甘肃等省[1]。海金沙多生于阴湿山坡灌丛中或路边林缘旁，以全草或者干燥成熟的孢子入药，味甘淡，性寒，有清热解毒、通淋止痛、利胆消肿的功效，为治疗泌尿系统感染、尿路结石、肾炎水肿、感冒发热、肠

炎，痢疾、癌症等疾病的常用中草药[2-5]。海金沙的化学成分主要有海金沙素、反式-对-香豆酸、咖啡酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、十六碳烯酸，亦含脂肪油、氨基酸、黄酮、多糖等物质[6-13]，因此海金沙植物资源的开发利用备受关注。但目前有关海金沙内生真菌的研究鲜见，而且由于对海金沙自然资源的不合理开发所造成的资源匮乏和环境破坏已成为亟待解决的问题。试验通过对海金沙内生真菌多样性的研究，旨在寻找替代海金沙的新药源，为采用微生物发酵技术生产具有抗肿瘤活性的有效成分物质提供理论依据，以减少对自然资源的直接利用，并为药用蕨类植物资源的野生保护和合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

分离内生真菌所用的植物材料为凤尾蕨海金沙植株的根、茎和叶，采自江西省九江市南湖公园。分离培养基为wa-抗生素培养基：琼脂20 g、氨苄青霉素200 mg、链霉素200 mg、去离子水1 000 ml；纯化培养基为改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基（pda）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、10% 海金沙叶水浸提液100 ml加去离子水定容至

1 000 ml，自然ph（使用前在培养基中加80 u/ml庆大霉素1 ml）；促孢培养基：kh2po4 1.0 g、kno3 1.0 g、mgso4·7h2o 0.5 g、kcl 0.5 g、淀粉0.

2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、琼脂20.0 g、去离子水1 000 ml，自然ph。

1.2.1 内生真菌的分离培养取新鲜的海金沙根、茎和叶，用自来水反复冲洗干净，在超净工作台上切成1 cm长的小段，然后进行表面消毒，具体操作流程是：无菌水→0.01%升汞（5 s）→无菌水→无菌水→70%乙醇（5 s）→无菌水→无菌水→无菌水，然后用无菌解剖刀剥取各器官的韧皮部，切成0.5 cm×0.5 cm大小的小片段。用无菌镊子将已经消毒的植物体放在pda平板上（平板在使用前要加庆大霉素，用量同前，并均匀推平），然后置于25 ℃恒温培养箱中培养，3～5 d后即可看见从植物体周围长出的菌丝。为了检查表面消毒是否彻底，另外做对照处理；将上述同样条件下处理过的材料不作切割直接种植于pda平板上，置于相同的条件下培养，以样品周围是否有菌丝生长来判断分离菌是否能确定为内生真菌。

1.2.2 内生真菌的分离与纯化观察从植物体上长出的菌落，挑取不同的菌落在新的平板上培养，反复多次直至得到纯种菌落，然后转入pda斜面培养基上（试管），再在28 ℃条件下纯化培养，4 ℃冰箱里保藏备用。

1.2.3 内生真菌的鉴定观察纯化好的单菌落真菌，记录其编号及来源并拍照。从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成装片，置于光学显微镜下观察真菌特征（菌丝、有性或无性孢子、孢子的着生状态等形态特征）。查阅有关真菌分类文献资料[14-16]，确认所分离获得的内生真菌的分类地位。

2 结果与分析