一种新型聚乙二醇化重组人生长激素的制备及性质考察
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1 仪器与材料
8823B 紫外检测仪 (北京宾达英创科技有限 公司 ) , M ode l 111 M i N i IEF cell( 美国 B io RAD 公 司 ) , DYY 6B 稳压稳流电泳仪 ( 北京市六一仪器 厂 ), Ag ilent1100 高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent公 司 ), TSK GEL G3000S W xL 色谱柱 ( 7 8 mm 300 mm, 5 m ) (日本 TOSOH 公司 ) , TS- 8 脱色摇床 ( 江苏海门其林医用仪器厂 ), Sephacry l S 200 、 Q Sepharose FF ( 美国 GE 公司 ) 。
和
100 mmo ∀ l L NaC l 的 5 mm ol∀ L PBS 水 溶 液 -1 (p H 值 7 2) 洗脱 , 其中 50 mm o ∀ l L 梯度洗脱的 是 PEG rhGH, 100 mm ol ∀ L 梯度洗脱的是目的蛋
-1
白 PEG ( rhGH ) 2 ( 图 1 的第 4、 3 道条带 )。
- 1 - 1
( 100 mmo∀ l L- 1 N aC l) #PEG ( rhGH ) 2; 4 Sa m ples e luted fro m Q Sepharose FF ( 50 mm o∀ l L- 1 N aC l) #PEG rhGH; 5 rhGH F ig. 1 SDS PAG E an alysis of pu rified PEG ylated rhGH
第 10 期
郭
凝等 : 一种 新型聚乙二醇化重组人生长激素的制备及性质考察
845
聚乙二醇 二丙 醛 ( PEG ( ALD ) 2, 分 子质 量 2 10 u , 北京键凯科技有 限公司 ) , 重组人生长
4
Sephacry l S 200 色谱柱 , 这一步的纯化主 要除掉 了未修饰的 rhGH 及多修饰带 ( 图 1 的第 2 道条 带 ) 。 Sephacry l S 200 纯化后的样品经 Sephadex G 25 柱色谱脱盐并更换缓冲溶液后上样 Q Seph arsoe FF 色谱柱 , 根据 PEG rhGH 与 PEG ( rhGH ) 2 存 在 的 电 荷 差 异 , 分 别 用 含 50 mm ol∀ L
2 方法与结果
2 1 PEG ( ALD) 2 对 rhGH 的修饰反应 将 rhGH 经凝 胶色谱柱 Sephadex G 25 置换 到 p H 值 为 6 2 的 5 mm o l ∀ L 磷 酸盐 缓 冲 液
-1
( PBS)中。 Low ry 法测定蛋白质量浓度 。调整 - 1 蛋白质 量 浓 度 至 4 g∀ L , 先 加 入 终 浓 度 为 20 mm o ∀ l L 的 NaCNBH 3, 再按 PEG 与蛋白质的
- 1
N aC l的 5 mm o ∀ lL
- 1
- 1
PBS 水溶 液 ( pH 值 7 2) 洗
- 1
脱 杂 蛋 白 , 用 含 100 mm o l∀ L
N aC l 的
5 mm o ∀ l L PBS 水溶 液 ( p H 值 7 2) 洗 脱目 的 蛋白 , 检测波长 280 nm。 2 3 SDS PAGE 电泳检测 将修饰混合物、 各洗脱峰 采用 SDS PAGE 电 [ 10] 泳检测 , 浓缩 胶质量分数为 5 % , 分离 胶质量 分数为 12 % 。结果见图 1 。 在本实验条件下 , PEG ( ALD ) 2 与 rhGH 反应 后的产 物 组分 , 主要 包括 未 修饰 的 rhGH、1 个 PEG 连接 1 个 rhGH 的 PEG rhGH、 1 个 PEG 连接 2 个 rhGH 的 PEG ( rhGH ) 2 及少量的多修饰产物, 如图 1 的第 1 道所示。其中 1 个 PEG 连接 2个 rh GH 的 PEG ( rhGH ) 2 为研究的目标产物。 根据混合物中蛋白的分子大小差异首先上样
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二醇
[ 6]
。末端醛基与蛋白以 C N 键相连 , 在体
[ 7]
内稳定性好 , 不发生水解 ; 可以通过在 PEG 两 端连接同样的蛋白质药物来制备复合物, 药物的 分子质量显著增大, 延长半衰期 , 而且有助于提高 该蛋白质药物的体内活性 。 作者利用 PEG ( ALD ) 2 修饰 rhGH, 通过适当 的修饰反应条件及纯化方法, 获得了一种新型聚 乙二醇化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ), 并对 其理化性质及药理作用进行了初步研究, 为该物 质的进一步研究和评价奠定了基础。
NaC l 的
20 mm o ∀ l L PBS 水溶 液 ( p H 值 7 4 ), 检 测 波 长 280 nm, 收集 目的蛋 白洗 脱液。将 目 的蛋 白 洗脱液经凝 胶色谱柱 Sephadex G 25 置换到 p H 值 7 2 的 5 mm o ∀ l L PBS 水溶 液中 , 然后上 样 - 1 Q Sepharose FF 离子交 换柱 , 用含 50 mm o ∀ l L
第 27 卷 第 10 期 2 0 1 0年 1 0月
沈
阳
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报
V o l 27
N o 10
Journa l o f Sheny ang Phar m aceutica lU nive rsity
O c. t 2010 p 767
文章编号 : 1006 2858( 2010) 10 0844 05
- 1
2 4 PEG ( rhGH ) 2 纯度的测定 SE H PLC法。采 用 TSK GEL G3000S W xL 分 析柱, 上样 20 L, 以 20 mm o ∀ l L PBS 水溶液 ( p H
- 1
值 6 5) 为流动 相, 检 测波 长为 214 nm, 流速 为 1 mL∀m in 。 结果见图 2 , PEG ( rhGH ) 2 的纯度质 量分数达 97 % 以上。
收稿日期 : 2010 03 08 基金项目 : 国家重大科技专项基金资助项目 ( 2008ZX 09401) 作者简介 : 郭凝 ( 1986 ), 女 ( 汉族 ), 黑龙江伊春人 , 硕士研究生 , E ma il guoning friend@ 163. com; 吴彦卓 ( 1972 ), 男 ( 汉族 ), 黑龙江庆安人 , 副研究员 , 博士 , 主要 从事基因 工程药物 研究 , T e.l 010 88799570, E mail yanzhuow u@ 163. com; 张景海 ( 1962 ), 男 ( 汉族 ), 辽宁丹 东人 , 教授 , 博士 , 主要 从事生 物化学 药物研 究 , T el . 024 23986431, E m ail jingha izhang2000@ y ahoo. com. cn 。
F ig. 2 Size exc lu sion H PLC profile of PEG ( rhGH ) 2
2 5 PEG ( rhGH ) 2 等电点的测定 样品 脱盐 后, 采用 等电 聚焦电 泳分 析等 电 点
[ 11]
, 结果见图 3 。
以各条带的迁移率对 pI 值作标准曲线 , 根据 样品的电泳迁移率 , 得出 PEG ( rhGH ) 2 的等电点 为 5 27 , 图 3谱中样品道为单一条带, 说明样品纯度
一种新型聚乙二醇化重组人生长激素的 制备及性质考察
郭 凝 , 杨仲璠 , 王俊玲 , 吴彦卓 , 徐明波 , 张景海
1 , 2 2 2 2 2 1
( 1 沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院 , 辽宁 沈阳 110016; 2 北京双鹭药业股份有限公司 , 北京 100041) 摘要 : 目的 制备一种新型聚乙二醇化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ), 并对其 理化性质及药理作 用进行研究。 方法 以分子质量为 2 104 u 的聚乙 二醇二 丙醛 ( PEG ( A LD ) 2 ) 对 重组人 生长激素 ( rhGH ) 进 行修饰 , 采用 Sephacry l S 200 凝胶过滤色 谱、 Q Sepharose FF 离子交换色谱对修饰 产物进 行分离纯化 , SD S PAGE 鉴定各组分 , 通过 SEC H PLC、IEF 、 MA LD I TOF M S 等方法对目 标产物进行 分析 , 并采用去脑垂体大鼠模型研究其体内生物活性与长效作用。 结果 获得了一种新型聚 乙二醇 化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ) 。其纯度质量分 数达到 97 % 以 上 , 等 电点为 5 27, 分子质量为 6 6 104 u 。与未修饰的 rhGH 相比 , PEG ( rhGH ) 2 具 有高 效、 长效的 促进 机体 生长的 药理 作用。 结论 新型聚乙二醇化重组人 生长激素 PEG ( rhGH ) 2 是一种 具有开 发前景的 长效蛋 白质药 物 , 值 得进一步深入研究。 关键词 : 重组人生长激素 ; 聚乙二醇 二丙醛 ; 化学修饰 ; 纯化 ; 长效 中图分类号 : Q 575 文献标志码 : A
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M
P ro te in m arker ; 1 R eaction m ix ture ; 2 Sa m ples after Sa m ples e lu ted fro m Q Sepharose FF
Sephacry l S 200; 3
物质的量比 1#2 加入 PEG, 混合均匀。 4 ∃ 搅拌 反应 16 Hale Waihona Puke Baidu 后, 加入过量甘氨酸终止反应。 2 2 修饰混合物分离 将修饰混合物 上样 Sephacry l S 200 凝胶 色 谱 柱 , 流 动 相 是 含 0 15 m o l∀ L
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第 27 卷
很高, 这与 SE HPLC 及 SDS PAGE 分析结果一致。
F ig. 4 M ass spectrom etric profile of PEG ( rhGH ) 2 M F ig. 3 ( rhGH ) 2 pIM arke r ; 1 PEG ( rhGH ) 2
- 1 - 1 - 1
激素原液 ( 纯度质量 分数 > 98 % , 北京双 鹭药业 股份有限公司 ), 蛋白质等电点标准 ( 德国 SERVA 公司 ), 低分子质量蛋白标准 ( 美国 GE 公司 ), 牛 血清白蛋白、 丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺、 十二烷 基硫酸钠、 四甲基乙二胺 ( 美国 Sigm a 公司 ), 其余 试剂 (国产分析纯或生化纯 , 市售 )。 SD 种大鼠, SPF 级, ! 性 , 出生 26 ~ 28 d ,体 质量 70~ 90 g , 中国药品生物制品检定所提供 , 合 格证号 SCXK( 京 ) 2006 0004 号。
人生长激素 ( hum an grow th ho r m one , hGH ) 是 人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的重要激素, 具有 促进人体生长发育和维持组织器官功能的生物功 能 , 临床主要用于治疗儿童的身材矮小症 , 同时也 广泛用于损伤、 严重烧伤的手术及后续治疗 。 虽然 rhGH 临床应用广泛, 但由于其在体内的半衰期 短, 需要每日注射, 限制其广泛使用。解决这一问题 目前较为理想的 方法是用聚乙 二醇 ( po lyethylene glyco,l PEG)对其进行分子修饰 。 最早有关 PEG 修饰 rhGH 的文献报道源自美 国 Genentech 公司的研究 , 后 来相继有一些关 于用 PEG 的衍生物对 rhGH 进行 化学修饰 的报 道 , 虽然所使用的方法和 PEG 的衍生物不同 , 但 结果都不 甚理想。主要 存 在的 问题 是: 在形 成 PEG 化 rhGH 时所用的某些连接键可能在体内水 解断裂 , 造成稳定性差; PEG 的结合使 rhGH 的生 物活性降低 , 需要增加剂量来补偿 ; 生产工艺复 杂 , 质量难以控制 , 难以大规模生产。 聚乙二 醇二 丙醛 ( PEG ( ALD ) 2 ) 是 在 PEG 链的两端各有 1 个丙醛基, 属于同端基遥爪聚乙
1 仪器与材料
8823B 紫外检测仪 (北京宾达英创科技有限 公司 ) , M ode l 111 M i N i IEF cell( 美国 B io RAD 公 司 ) , DYY 6B 稳压稳流电泳仪 ( 北京市六一仪器 厂 ), Ag ilent1100 高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent公 司 ), TSK GEL G3000S W xL 色谱柱 ( 7 8 mm 300 mm, 5 m ) (日本 TOSOH 公司 ) , TS- 8 脱色摇床 ( 江苏海门其林医用仪器厂 ), Sephacry l S 200 、 Q Sepharose FF ( 美国 GE 公司 ) 。
和
100 mmo ∀ l L NaC l 的 5 mm ol∀ L PBS 水 溶 液 -1 (p H 值 7 2) 洗脱 , 其中 50 mm o ∀ l L 梯度洗脱的 是 PEG rhGH, 100 mm ol ∀ L 梯度洗脱的是目的蛋
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白 PEG ( rhGH ) 2 ( 图 1 的第 4、 3 道条带 )。
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( 100 mmo∀ l L- 1 N aC l) #PEG ( rhGH ) 2; 4 Sa m ples e luted fro m Q Sepharose FF ( 50 mm o∀ l L- 1 N aC l) #PEG rhGH; 5 rhGH F ig. 1 SDS PAG E an alysis of pu rified PEG ylated rhGH
第 10 期
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凝等 : 一种 新型聚乙二醇化重组人生长激素的制备及性质考察
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聚乙二醇 二丙 醛 ( PEG ( ALD ) 2, 分 子质 量 2 10 u , 北京键凯科技有 限公司 ) , 重组人生长
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Sephacry l S 200 色谱柱 , 这一步的纯化主 要除掉 了未修饰的 rhGH 及多修饰带 ( 图 1 的第 2 道条 带 ) 。 Sephacry l S 200 纯化后的样品经 Sephadex G 25 柱色谱脱盐并更换缓冲溶液后上样 Q Seph arsoe FF 色谱柱 , 根据 PEG rhGH 与 PEG ( rhGH ) 2 存 在 的 电 荷 差 异 , 分 别 用 含 50 mm ol∀ L
2 方法与结果
2 1 PEG ( ALD) 2 对 rhGH 的修饰反应 将 rhGH 经凝 胶色谱柱 Sephadex G 25 置换 到 p H 值 为 6 2 的 5 mm o l ∀ L 磷 酸盐 缓 冲 液
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( PBS)中。 Low ry 法测定蛋白质量浓度 。调整 - 1 蛋白质 量 浓 度 至 4 g∀ L , 先 加 入 终 浓 度 为 20 mm o ∀ l L 的 NaCNBH 3, 再按 PEG 与蛋白质的
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N aC l的 5 mm o ∀ lL
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脱 杂 蛋 白 , 用 含 100 mm o l∀ L
N aC l 的
5 mm o ∀ l L PBS 水溶 液 ( p H 值 7 2) 洗 脱目 的 蛋白 , 检测波长 280 nm。 2 3 SDS PAGE 电泳检测 将修饰混合物、 各洗脱峰 采用 SDS PAGE 电 [ 10] 泳检测 , 浓缩 胶质量分数为 5 % , 分离 胶质量 分数为 12 % 。结果见图 1 。 在本实验条件下 , PEG ( ALD ) 2 与 rhGH 反应 后的产 物 组分 , 主要 包括 未 修饰 的 rhGH、1 个 PEG 连接 1 个 rhGH 的 PEG rhGH、 1 个 PEG 连接 2 个 rhGH 的 PEG ( rhGH ) 2 及少量的多修饰产物, 如图 1 的第 1 道所示。其中 1 个 PEG 连接 2个 rh GH 的 PEG ( rhGH ) 2 为研究的目标产物。 根据混合物中蛋白的分子大小差异首先上样
[ 5] [ 3- 4] [ 1- 2]
二醇
[ 6]
。末端醛基与蛋白以 C N 键相连 , 在体
[ 7]
内稳定性好 , 不发生水解 ; 可以通过在 PEG 两 端连接同样的蛋白质药物来制备复合物, 药物的 分子质量显著增大, 延长半衰期 , 而且有助于提高 该蛋白质药物的体内活性 。 作者利用 PEG ( ALD ) 2 修饰 rhGH, 通过适当 的修饰反应条件及纯化方法, 获得了一种新型聚 乙二醇化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ), 并对 其理化性质及药理作用进行了初步研究, 为该物 质的进一步研究和评价奠定了基础。
NaC l 的
20 mm o ∀ l L PBS 水溶 液 ( p H 值 7 4 ), 检 测 波 长 280 nm, 收集 目的蛋 白洗 脱液。将 目 的蛋 白 洗脱液经凝 胶色谱柱 Sephadex G 25 置换到 p H 值 7 2 的 5 mm o ∀ l L PBS 水溶 液中 , 然后上 样 - 1 Q Sepharose FF 离子交 换柱 , 用含 50 mm o ∀ l L
第 27 卷 第 10 期 2 0 1 0年 1 0月
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Journa l o f Sheny ang Phar m aceutica lU nive rsity
O c. t 2010 p 767
文章编号 : 1006 2858( 2010) 10 0844 05
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2 4 PEG ( rhGH ) 2 纯度的测定 SE H PLC法。采 用 TSK GEL G3000S W xL 分 析柱, 上样 20 L, 以 20 mm o ∀ l L PBS 水溶液 ( p H
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值 6 5) 为流动 相, 检 测波 长为 214 nm, 流速 为 1 mL∀m in 。 结果见图 2 , PEG ( rhGH ) 2 的纯度质 量分数达 97 % 以上。
收稿日期 : 2010 03 08 基金项目 : 国家重大科技专项基金资助项目 ( 2008ZX 09401) 作者简介 : 郭凝 ( 1986 ), 女 ( 汉族 ), 黑龙江伊春人 , 硕士研究生 , E ma il guoning friend@ 163. com; 吴彦卓 ( 1972 ), 男 ( 汉族 ), 黑龙江庆安人 , 副研究员 , 博士 , 主要 从事基因 工程药物 研究 , T e.l 010 88799570, E mail yanzhuow u@ 163. com; 张景海 ( 1962 ), 男 ( 汉族 ), 辽宁丹 东人 , 教授 , 博士 , 主要 从事生 物化学 药物研 究 , T el . 024 23986431, E m ail jingha izhang2000@ y ahoo. com. cn 。
F ig. 2 Size exc lu sion H PLC profile of PEG ( rhGH ) 2
2 5 PEG ( rhGH ) 2 等电点的测定 样品 脱盐 后, 采用 等电 聚焦电 泳分 析等 电 点
[ 11]
, 结果见图 3 。
以各条带的迁移率对 pI 值作标准曲线 , 根据 样品的电泳迁移率 , 得出 PEG ( rhGH ) 2 的等电点 为 5 27 , 图 3谱中样品道为单一条带, 说明样品纯度
一种新型聚乙二醇化重组人生长激素的 制备及性质考察
郭 凝 , 杨仲璠 , 王俊玲 , 吴彦卓 , 徐明波 , 张景海
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( 1 沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院 , 辽宁 沈阳 110016; 2 北京双鹭药业股份有限公司 , 北京 100041) 摘要 : 目的 制备一种新型聚乙二醇化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ), 并对其 理化性质及药理作 用进行研究。 方法 以分子质量为 2 104 u 的聚乙 二醇二 丙醛 ( PEG ( A LD ) 2 ) 对 重组人 生长激素 ( rhGH ) 进 行修饰 , 采用 Sephacry l S 200 凝胶过滤色 谱、 Q Sepharose FF 离子交换色谱对修饰 产物进 行分离纯化 , SD S PAGE 鉴定各组分 , 通过 SEC H PLC、IEF 、 MA LD I TOF M S 等方法对目 标产物进行 分析 , 并采用去脑垂体大鼠模型研究其体内生物活性与长效作用。 结果 获得了一种新型聚 乙二醇 化重组人生长激素 ( PEG ( rhGH ) 2 ) 。其纯度质量分 数达到 97 % 以 上 , 等 电点为 5 27, 分子质量为 6 6 104 u 。与未修饰的 rhGH 相比 , PEG ( rhGH ) 2 具 有高 效、 长效的 促进 机体 生长的 药理 作用。 结论 新型聚乙二醇化重组人 生长激素 PEG ( rhGH ) 2 是一种 具有开 发前景的 长效蛋 白质药 物 , 值 得进一步深入研究。 关键词 : 重组人生长激素 ; 聚乙二醇 二丙醛 ; 化学修饰 ; 纯化 ; 长效 中图分类号 : Q 575 文献标志码 : A
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P ro te in m arker ; 1 R eaction m ix ture ; 2 Sa m ples after Sa m ples e lu ted fro m Q Sepharose FF
Sephacry l S 200; 3
物质的量比 1#2 加入 PEG, 混合均匀。 4 ∃ 搅拌 反应 16 Hale Waihona Puke Baidu 后, 加入过量甘氨酸终止反应。 2 2 修饰混合物分离 将修饰混合物 上样 Sephacry l S 200 凝胶 色 谱 柱 , 流 动 相 是 含 0 15 m o l∀ L
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第 27 卷
很高, 这与 SE HPLC 及 SDS PAGE 分析结果一致。
F ig. 4 M ass spectrom etric profile of PEG ( rhGH ) 2 M F ig. 3 ( rhGH ) 2 pIM arke r ; 1 PEG ( rhGH ) 2
- 1 - 1 - 1
激素原液 ( 纯度质量 分数 > 98 % , 北京双 鹭药业 股份有限公司 ), 蛋白质等电点标准 ( 德国 SERVA 公司 ), 低分子质量蛋白标准 ( 美国 GE 公司 ), 牛 血清白蛋白、 丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺、 十二烷 基硫酸钠、 四甲基乙二胺 ( 美国 Sigm a 公司 ), 其余 试剂 (国产分析纯或生化纯 , 市售 )。 SD 种大鼠, SPF 级, ! 性 , 出生 26 ~ 28 d ,体 质量 70~ 90 g , 中国药品生物制品检定所提供 , 合 格证号 SCXK( 京 ) 2006 0004 号。
人生长激素 ( hum an grow th ho r m one , hGH ) 是 人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的重要激素, 具有 促进人体生长发育和维持组织器官功能的生物功 能 , 临床主要用于治疗儿童的身材矮小症 , 同时也 广泛用于损伤、 严重烧伤的手术及后续治疗 。 虽然 rhGH 临床应用广泛, 但由于其在体内的半衰期 短, 需要每日注射, 限制其广泛使用。解决这一问题 目前较为理想的 方法是用聚乙 二醇 ( po lyethylene glyco,l PEG)对其进行分子修饰 。 最早有关 PEG 修饰 rhGH 的文献报道源自美 国 Genentech 公司的研究 , 后 来相继有一些关 于用 PEG 的衍生物对 rhGH 进行 化学修饰 的报 道 , 虽然所使用的方法和 PEG 的衍生物不同 , 但 结果都不 甚理想。主要 存 在的 问题 是: 在形 成 PEG 化 rhGH 时所用的某些连接键可能在体内水 解断裂 , 造成稳定性差; PEG 的结合使 rhGH 的生 物活性降低 , 需要增加剂量来补偿 ; 生产工艺复 杂 , 质量难以控制 , 难以大规模生产。 聚乙二 醇二 丙醛 ( PEG ( ALD ) 2 ) 是 在 PEG 链的两端各有 1 个丙醛基, 属于同端基遥爪聚乙