植物新基因克隆的策略与方法

原理
T-DNA标签法以人工构建好的T-DNA作
为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，
在对突变体鉴定的基础上，根据插入片段设计 引物扩增突变体中插入点侧翼的植物基因组序 列，最终实现快速鉴定和基因克隆。

技术流程
1）遗传转化，获得T-DNA插入突变体； 2）通过分子和遗传方法鉴定突变体； 3）提取DNA,酶切,环化,反向PCR扩增突变基因； 4）经序列分析后,从野生型对照中克隆突变基因。



原理 转座子标记法是应用遗传转化方法将
转座子转入受体植物中，利用转座子的特
性，从分离后代中鉴定突变体，然后采用
反向PCR技术克隆突变位点基因。

技术流程
将已分离得到的转座 子与选择标记构建成含 转座子的质粒载体；
(1)
(2) 把转座子导入目标 植物；
(3) 利用Southern 杂交 等技术检测转座子是否 从载体质粒中转座到目 标植物基因组中； (4) 采 用 反 向 PCR 技 术 克隆突变位点基因。

技术特点
（1）假阳性率大大降低； （2）高敏感性； （3）速度快，效率高； （4）SSH还具有背景低，重复性好的特点。

应用
抑制性消减杂交技术已经被广泛地应用于 各种植物功能基因的克隆。

RNA随机引物PCR指纹技术（arbitrarily primer PCR finger printing of RNA，RAPPCR）
图1 ������
反向PCR 示意图

技术特点
优点： - 方法简单； - 易获得大量突变体。 不足： - 由于T-DNA插入是随机事件，会出现多点插入 或在一点多片段插入，导致后期筛选的复杂性。

转座子标签法
转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的
DNA片段;

在转座过程中原来位置的DNA片段(转座子)并


基于基因组DNA的克隆
即是以DNA为模板或对象的克隆。
图位克隆 T-DNA标签法 转座子标签法


图位克隆
图位克隆 (mapbased cloning), 是由英国剑桥 大学Coulson等人于1986年首次提出。

原理
是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的 基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精 确定位的基础上，用AC等），构建目的基因区域的物理图谱，再利 用 此 图 谱 通 过 染 色 体 步 移 （ chromosome walking ）逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因， 并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。

原理 通过合成两个不同的接头，接于经限制性 内切酶消化后的测试（tester）cDNA 片段的5’ 末端，将测试和驱动(driver)进行两轮杂交。标 准化步骤均等了测试中的cDNA 单链丰度，消 减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列。 利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段， 同时抑制非目的cDNA 的扩增。 因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获 得低丰度差异表达的cDNA的概率。

RAP-PCR 技术由Welsh J 等1992 年提出。
它是以PCR 为基础构建RNA 指纹图谱, 是研
究基因差异表达的有效方法。

原理
以RNA 为模板，在低严谨度条件下反转录产生 cDNA 第一链和第二链。随后用PCR 扩增来富集产物 , 引物与反转录所用引物相同, 在 反 应 体 系 中 用 35SdATP或32P-dCTP, 进行放射性标记。经扩增后的产 物在4%的测序胶上电泳, 然后放射自显影。也可用非 放射性标记如荧光标记、银染等方法。将不同样品, 如同一品系不同组织的细胞或不同品系同一组织细胞 的扩增产物作对照, 可以将差异表达的微量mRNA 放 大, 建立RNA 群体的指纹图谱,在凝胶或X 光片上显示 出cDNA 带谱的表型差异。

cDNA-AFLP技术 cDNA-AFLP（cDNA-amplified fragment length polymorphism）技术结合了RT-PCR和 AFLP技术的分子标记技术。

原理
以纯化的mRNA为模板，反转录合成
cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种
限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人




技术流程 蛋白质双向电泳获得蛋白表达图谱； 比较处理与对照蛋白图谱的差异，找出差异蛋 白点； 回收差异蛋白，纯化，测序； 根据蛋白序列，预测列。

应用 功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多 基因的分离利用这种策略。如： -从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯 乙烯合成酶基因(VNA(周兆斓等,1996)； -从烟草中克隆了编码黄瓜花叶病毒病毒外壳蛋 白的cDNA基因(胡天华等,1989)； -从感病的烟草叶片中克隆了完整的马铃薯x病 毒外壳蛋白基因 (王春香等,1991)。

技术特点 - 需要的模板量少； - 重复性好，假阳性低，可检测低丰度表达的 mRNA ； - 准确反映基因间表达量的差别； - cDNA-AFLP不需要预先知道任何序列信息， 且实验操作简便，可在任何实验室进行。适合 对生物体转录组进行全面分析。

抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH） SSH 即 抑 制 消 减 杂 交 技 术 ， 是 由 Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示 技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因 的新技术。

原理
真核生物基因的mRNA 3′端多数都带有一段多聚 腺苷酸结构，有12种组合：5′-NMAAA…AA-3′其中N 代表A、G、C、T任意一种碱基，M代表G、C、T任意一 种碱基。根据此种序列特征，按碱基配对的原则，人 工合成Poly(dT)引物，此引物可将mRNA反转录成cDNA （又称为第1链），用5′端随机引物与cDNA第1条链 互补进行PCR，随机扩增cDNA片段。将PCR产物在变性 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，即可显示不同的条带 位置，比较不同组间的显示结果，挑选差异条带，经 回收再扩增，通过杂交验证、克隆测序。

mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)
DDRT-PCR(differential display reverse transcription PCR)。1992年美国哈佛医学院 的两名科学家Liang P和Pardee A D 根据高等 生物成熟的mRNA都带有poly(A)的特性，用特 定的锚定引物反转录后，进行PCR扩增，率先 建立了mRNA差异显示技术。1994年Eric Hay 等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合 酶链式反应（DDRT-PCR）。




功能克隆法 DDRT-PCR技术 cDNA-AFLP技术 SSH技术 RAP-PCR技术 高通量测序技术

电子克隆

功能克隆法
这是一个建立在差 异蛋白组分析基础上 的基因克隆方法。

原理
在对获得的克隆蛋白测序的基础上相应长序列。

技术流程
1) 测试材料：tester; 对照材料：driver；
2) cDNA合成：通过反转录获得cDNA； 3）cDNA酶切； 4) 加接头（adapter），将tester cDNA分成 两组：tester 1和tester 2, 一份与Adaptor1 连接，另一份与Adaptor2连接（5’端）； 5)第一次差减杂交,使连接一种接头的差异 表达基因a初步富集 ； 6)第二次差减杂交,形成了新的连接有两种 接头的双链杂交片段,作为PCR指数扩增的 模板； 7）两轮PCR,特异扩增代表了差异表达的 cDNA片段； 8）将PCR所得的差别表达基因片段插入适 当载体,转化细菌。经筛选,获得具有差异表 达cDNA片段的阳性克隆。然后通过序列分 析,可获得一些新的ESTs序列。

技术流程

技术特点
优点:
- 应用范围广，可以克隆所有类型的基因； - 不受基因大小限制，可以克隆大片段基因； - 克隆的基因是基因全长，包含编码序列和非编码序 列。
局限：
- 需要遗传群体； - 工作量大，时间长。

应用
图位克隆法已经被广泛地应用在植物新基因 的克隆中。 已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水
稻等植物中的有关抗病基因，如： - 番茄pto基因 (Martin等,1993)； - 水稻Xa21基因(Wenyuan等,1995)。

T-DNA标签法
T-DNA(Transfer DNA)是根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) Ti (tumor inducing)质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌 中被转移并稳定整合到植物核基因组中。
未消失,发生转移的只是转座子的拷贝; 基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基 因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现 新的编码基因。


在植物上,目前使用的转座子有: 玉米的Ac/Ds 和En/Spm, 金鱼草的Tam3; 这些转座子不仅能够同源转座,而且还能异源 转座;
转座子可以转到DNA分子的任意位置,但不是 随机的。
植物新基因克隆的策略与方法
生命科学学院 杨 清
植物生长发育与基因
小麦
水稻
番茄
马铃薯
基因的概念
马铃薯3GT cDNA的核苷酸序列与对应的
为何进行基因克隆?
- 研究特定性状的遗传； - 用于改良植物的遗传特性。

如何从植物中获得（取出）新基因? 有两个策略: 基于基因组DNA的克隆； 基于cDNA(基因差异表达)的克隆。

技术特点 转座子标签法具有与T-DNA标签法类似的 优点。 但该法的效果受到转座子自身的位置效应 和计量效应的影响。

应用
目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物 中克隆出抗性基因，如： -玉米的HMI特异真菌抗性基因。

基于cDNA(基因差异表达)的克隆
以cDNA(mRNA)为模板的基因克隆。
工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进 行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳显示。

技术流程 （1）模板的制备和cDNA的合成； （2）双链cDNA片段的酶切和人工接头的连接； （3）酶切片段的预扩增和选择性扩增； （4）凝胶电泳； （5）比较处理组与对照组电泳图谱，找出差异 条带； （6）回收差异条带，PCR富集，克隆； （7）测序，功能注释，然后进行基因的全长克 隆。

技术特点
（1）假阳性率高，假阳性的 比例有时高达50％～75％。 ①简单，技术上仅仅依靠 （2）由于某些序列的特异性， PCR和DNA测序胶电泳； 一些差异表达的转录不能得到 ②可以同时分析多组样品； 分离，所以凝胶中的单条带可 ③灵敏性高，仅需0.2 μg 能由1种以上cDNA片段所构 总 RNA 作 为 起 始 材 料 ， 成。 可检出低丰度mRNA； ④实验周期短，约8 d即 （3）差异显示所得的cDNA 片段较短，长度多在100 bp～ 可完成，便于重复； ⑤最突出的优点是实验过 400 bp 之 间 ， 且 大 多 位 于 程中可步步验证比较；������ mRNA 3′端约300 bp的非翻译 区 （ untranslated regions,3′UTR）。

技术流程
(1) 提取两种细胞的mRNA,反转
录后成为2种cDNA；
(2) 以随即引物和猫定引物作随 机聚合酶链反应； (3) 通过扩增产物的电泳分析,分 离出不同样品间的差异条带； (4)将差异DNA做成探针进 行RT-PCR和RACE扩增基因。

技术流程
1. 制备组织； 2. 提取RNA； 3. 逆转录； 4. PCR 扩增； 5. 显示RNA 指纹图谱； 6. 回收条带并扩增；