专家解答体内荧光成像技术难点

专家解答体内荧光成像技术难点

1.如何解决组织吸收问题

来自斯坦福大学放射学系助理教授Jianghong Rao领导的研究小组在进行“Examining protease involvement in tumor metastasis and cell migration”（肿瘤转移与细胞迁移过程中涉及的蛋白酶）这一项研究中遇到了一个难题：利用标准的荧光分子标记观测深部组织，激发荧光的光源必须能穿透具有强吸收力和光散射的组织，并且当标记分子发出光时，也要能通过同样的组织块，从而被检测到。

为了解决这个难题，研究人员采用了一种称为生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的方法进行组织成像。不同于利用生物体外激发光源的能量转移方法，BRET主要依赖于生物发光的荧光素酶来提供荧光标记需要的能量转移。一般而言，进行BRET实验的研究人员是将与荧光素酶与荧光蛋白相交联，后者会吸收生物荧光，并重新发出光，但是由于这些BRET交联物的光仍然有大部分会被吸收和散射掉，因此剩下的信号依然很弱。

Rao改进了这一方法，他将荧光素酶交联在quantum dots (QDs)，而不是荧光蛋白上，这就将发出的光线变成了依然是长波长，但吸收和散射不强的光。为了能对深部组织进行成像，Rao等人又将luciferase-QD这个结构连接上了一个配体——这个配体与目的分子相连。这样当将底物，复合体（包括荧光素酶的荧光基团）注入小鼠的尾静脉的时候，BRET标记就能发出两种特殊的光：蓝色的生物荧光和红色的quantum-dot光，这样就能更清楚的观测组织。

这里Rao用于解决组织吸收问题的是一类新型的荧光探针，即量子点Qdot或称为半导体纳米晶体，所谓Qdot，指的是准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。

这种纳米材料对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等，能够发射不同波长光谱，可以为单一波长所激发，适用于在一个实验中检测多靶点，因此非常适合活细胞成像和动态研究，甚至有人认为这种纳米荧光是纳米技术的真正代表，给荧光技术带来革命性的突破。

其具体特点如下：

·QDs的发射谱单一而且很“窄”。其半峰宽（FWHM）大都在40nm以下，更好的可以达到30nm甚至十几个nm，因此，QDs作为探针，可以很方便的区别于背景信号或者其它探针的信号。

·QDs的激发谱很宽，可以在低于发射谱的广泛区间内任意选择激发波长。这个属性使得对设备（光源）的选择变得更加方便，而不必受限于特殊激光器。QDs的这个特点还可以让我们在同一固定激发波长下，同时激发不同颜色的QDs，从而使需要实时观测多种目标分子运

动或反应的实验变得从容不迫和得心应手。

·QDs的发光强度高。与常用的有机小分子染料相比，QDs的发光强度要高几倍乃至几十倍。这一方面取决于QDs的荧光量子效率，另外也决定于QDs的摩尔消光系数。毋庸置疑，高发光强度能够更为方便地从复杂背景中（如自发荧光）提取需要的信号。

·QDs的稳定性很好。虽然早期的QDs在光学/化学稳定性上不存在非常突出的优势，但近年来技术的改进是QDs的稳定性大幅提高，在生理条件下可以保持几个月而没有明显的衰减。

·QDs表面经过化学修饰，可以携带氨基、羧基、巯基等，可以方便地与选择的生物分子缀合，而不必再为构建探针的策略而惮心竭虑，而这几种化学反应的效率，已经可以足够满足构建探针的要求。

·超高的表面积-体积比允许QDs表面存在丰富的化学基团，为选择构建多功能探针提供了优秀的平台，比如，构建同时具有细胞/组织靶向性、跨膜属性、核定位属性以及治疗特性的QDs生物探针。

目前市面上此类染料并不是十分常见，经典的纳米荧光染料主要来自同名注册的公司：Quantum Dot公司，这家公司注册于1998年，创办者是麻省理工学院的Moungi Bawendi和加利福尼亚大学的Paul，这家公司由此在财政上获得3，750万美元的利润，《财富》还将这一项技术列为2003年具有突破性的尖端技术之一。目前这家公司已被Invitrogen以八位数的金额收购了（Invitrogen现在也改名了，合并ABI后将改名为生命技术公司）。

Qdot是Quantum Dot公司革命性的纳米荧光染料，制作过程是将镉和硒一起放在溶液中加热，形成半导体晶体。轻微的改变过程可形成不同大小和组成的晶体，因此他们将发出不同的光。将锌和硫加入混合物，在每一个晶体上形成一个壳，然后晶体包被一层可产生共轭的分子，它们可吸附蛋白。

在显微镜下可以看到这些纳米晶体，细胞中的Qdot在同一光线下呈现多种颜色，显示它们的大小和组成不同。它们比荧光蛋白和染料更明亮，保持时间更长。因此Qdots可以应用于细胞分析，基因表达和医学诊断，通过研究这些与蛋白质相连的发光晶体，还可跟踪这些蛋白质来研究样本中的细胞，另外Qdots还用于分析癌细胞中的基因组成，以及检测治癌药物与其靶细胞结合情况。值得一提的是其相关的专利也有华人科学家的贡献，比如复旦大学生科院的兼职教授，加州大学劳伦斯伯克利国家实验室的陈帆青教授。

Quantum Dot公司相应的Qdot系列产品能满足流式细胞术、荧光显微镜、激光共聚焦、甚至Western Blot的检测需求。价格方面也不是很贵，比如上面Rao博士用的Qdot的价格目前是319美元（250 ml, 8 mM solution），在体内成像方面遇到了相同问题的实验人员可以考虑一下。

另外松下（Matsushita）公司也开发出了用于研究的Qbead微珠的装置，可以配合Qdot的使用，其中多达200个独特标记的微珠吸附在探针上并结合了Qdot，使研究人员可以在一个样品中检测超过200个不同基因。这个系统可以让研究者一天从几千个样品中检测数百个基因。而且这种微珠有足够的灵敏度可检测少至100，000个RNA分子，这比微阵列方法灵敏得多，同时针对Qdot，Matsushita也设计制造出了Quantum Dot Mosaic Q100扫描仪。