单细胞测序

测序与数据分析
STARTRAC
(single T-cell analysis by RNA-seq and TCR tracking)
A cartoon illustrating four indices defined by STARTRAC to characterize T cell dynamics
肿瘤微环境中T细胞动态变化
(1)STARTRAC-dist ：
CD8 + T cells：
blood： TN, TCM, TEMRA tumour： TEX、TEM normal mucosa： TRM
(2)STARTRAC-expa：
TEMRA,TEX
(3)STARTRAC-migr:
TEMRA

Highlight 3: New co-stimulatory factor function identification

Highlight 4: Comparison of multiple cancer T cells
Thank you for listening
Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer Nature IF=28
汇淋巴细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中有着核心作 用。肿瘤浸润淋巴细胞在细胞类型、基因表达和 功能特性方面具有着高度异质性。这些异质性不 仅反应了肿瘤免疫抑制的不同机制，同时也影响 了肿瘤免疫治疗的效果。 免疫检查点抑制剂治疗改变了多种肿瘤的治疗 前景。在结肠癌中，相较于微卫星稳定 （Microsatellite stable，MSS）的病人而言，基因组 微卫星不稳定（Microsatellite-instable，MSI）的病 人响应免疫检查点抑制剂治疗要好，然而具体机 制未知。因此，深度阐释结直肠癌T细胞特性，了 解两类病人间T细胞的特征差异，可为人们进一步 发掘新的治疗靶点和策略提供契机。
CD4+T cells：
blood： TN, TEMRA tumour：TH17,IFNG+ TH1-like,TEX normal mucosa：TFH ，TRM
(4)STARTRAC-tran:
TEMRA
TEM
TEX
MSI and MSS
Fig. 3 | Clonal TH1-like T cells are enriched in MSI tumours
Fig5:Expression levels of IGFLR1 in activated CD8+ Tconv and TCS cells
Comparative analysis of T cells from different cancer
Fig6:Composition of different CD8+/CD4+ T cells in each tumour type by different tissue origins. CD8+ T cell clusters with frequencies below 3% are not labelled.

单细胞分离
细胞溶解与基因组DNA获取 全基因组扩增 测序与数据分析



单细胞分离



连续稀释法 显微操作法 激光捕获显微切割术 (laser capture microdissection,LCM） 拉曼镊子技术( Raman tweezers) 荧光激活细胞分选术 ( fluorescence activated cell sorting,FACS) 微流控技术( microfluidics)
单细胞测序流程

单细胞分离
细胞溶解与基因组DNA获取 全基因组扩增 测序与数据分析



全基因组扩增


全基因组扩增技术主要分为两种类型： 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术， 如简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)，连接 反应介导的PCR (LM-PCR)，扩增前引物延 伸反应(PEP)等， 一是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技 术，如多重置换扩增(MDA)和基于引物酶的 全基因组扩增(pWGA)
CD8+ T cell
Fig. 1 | Properties of CD8+ T cell clonal expansion, migration and developmental transition.
CD4+ T cell
Fig. 2 | Properties of CD4+ T cell clonal expansion, migration and developmental transition.
MSI和MSS病 人差异分析
Data Acquisition Process of Colorectal Cancer T Cells
单细胞测序
单细胞测序技术是能够在单个细胞的水平上，对基因组进行 高通量测序分析的一项新技术。原理是将分离的单个细胞中微量 的mRNA通过高效扩增后再进行高通量测序。
Summary

Highlight 1: STARTRAC bioinformatics analysis
method

Highlight 2: T cell group and molecular difference in patients with colorectal cancer from MSI and MSS
测序与数据分析
单细胞数据由于表现出不均匀的覆盖度和 高比例的嵌合序列，则需要采用不同的分析 方法进行数据预处理。 一法是将亲缘关系很近的单细胞测序 数据进行混合分析。从偏倚性的角度来看 混合分析可以显著地提高样品的平均覆盖 度。
CXCL13+BHLHE40+TH1-like
MSI:
IFNG+TH1-like
GZMK+IFNG+TEM(CD4+TEM)
MSS:
TH17
IGFLR1
Fig. 4 | IGFLR1 functions as a co-stimulatory receptor in T cells
The role of IGFLR1 in CD8+Tex cells
主要内容
组织分布
T细胞
克隆 迁移 状态转变 新类群—CXCL13+BHLHE40+
MSS和MSI
TH1- like cells
新协同刺激因子—IGFLR1
实验流程
T细胞分离及 其测序
T细胞动态变 化分析
STARTRAC
(single T-cell analysis by RNA-seq and TCR tracking)