微生物学实验讲义

实验一玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌

一、目的要求

1、熟悉微生物实验所需的各种常用器皿名称和规格；

2、掌握对各种器皿清洗方法；

3、掌握玻璃器皿的干热灭菌操作过程；

4、了解手提式高压蒸汽灭菌锅的结构、使用方法和操作要点。

二、基本原理

为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物的营养体，包括芽胞和孢子。灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。细胞内的蛋白质凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强；湿热的蒸汽有潜热存在，从而增加灭菌效力。

三、实验器材

1、吸管，试管，三角瓶，试管刷，棉花，报纸、包扎绳、去污粉等；

2、手提式高压蒸汽灭菌锅。

四、实验步骤

1、玻璃器皿的洗涤

清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。

1）不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用酸性溶液（2%的盐酸溶液）浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。

2）用过的器皿应立即洗涤。

3）强酸，强碱，琼脂等能腐蚀，阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。

一般的器皿都可用去污粉，肥皂或配成5%的热肥皂水来清洗。油脂很重的器皿应先将油脂擦

去。沾有煤膏，焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂(苯，二甲苯，汽油，丙酮，松节油等)揩去。

4）洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。

2、玻璃器皿的包扎

为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿（培养皿、三角瓶、试管、移液管等）均需包扎。

3、灭菌

高压蒸汽灭菌：此灭菌方法用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。

1）首先将内层锅取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

注意：切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。

注意：不要装得太挤，以妨蒸汽流通；带有面塞的玻璃器皿其口端不要与桶壁接触，以免冷凝水深入面塞。

3）加盖，将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。

4）通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（本实验用0.1MPa，121℃，20min灭菌）

5）灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

注意：压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀。如果压力未降到“0”时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

五、思考题

1、高压蒸气灭菌前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降为“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

2、在使用高压蒸气灭菌锅时，怎样杜绝一切不安全的因素？

实验二革兰氏染色技术

一、目的要求

1、学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。

2、初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。

3、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性

二、基本原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。其基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。经此方法后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了燃料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、脂类质含量低，用乙醇脱色时细胞脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂类含量高，所以当被脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

三、实验器材

1、菌种：大肠杆菌

2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红染液、石炭酸复红染液、二甲苯、香柏油

3、仪器：显微镜、废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸

四、操作步骤

1、制片：取干净载玻片一块，在载玻片的中央加一滴蒸馏水，用接种环以无菌操作法取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

注意：取菌不要太多；涂片要均匀，不易过厚。