高级生化 蛋白质组成和结构分解
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2
高级生化教学互动讨论主题
• 这是教学计划中安排的讨论课主题，要求同学们 围绕下列内容中的一个方面或一种方法等，也可 以结合自己本科论文，自己做ppt,并在课堂上交 流.每人5-8分钟，从第5周开始。
• 第一块：关于蛋白质 • 1. 蛋白质结构及其研究方法 • 2. 蛋白质的分离方法、原理和应用（有多种） • 3. 蛋白质测定方法及其应用特点 • 4. 免疫化学及免疫分析 • 5. 蛋白质的改性及其应用 • 6. 围绕奶粉事件谈奶粉标准的制定
蛋白种类
小麦蛋白 大麦蛋白 大米蛋白 玉米蛋白 花生蛋白 大豆蛋白
含氮％
18.58 17.15 16.81 16.00 18.32 17.51
蛋白种类 含氮％
源自文库
乳全蛋白 乳球蛋白 卵蛋白 血清白蛋白 组蛋白 明胶
15.87 16.00 15.76 15.80 17.90 18.14
8
如何正确应用凯氏定氮法 测定蛋白质含量
20
4。氨基酸分析结果
21
22
Elite-AAA氨基酸分析系统液相色谱仪
23
分析仪器实例
• Elite－AAA氨基酸分 析系统采用色谱工作 站精确控制高精度两 元液相色谱高压梯度 系统，提供精确的流 速和流动相组分控制， 采用DNFB柱前衍生 及专用氨基酸分析色 谱柱，使十八种氨基 酸能到很好的分离， 并用紫外检测器完成 氨基酸的检测。
CH3 CH3 N
pH9.
H2N—CH—COOH +
7 40℃
R
O=S=
O Cl
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
CH3 CH3 N
O=S= O HN—CH—COOH
R
DNS-氨基酸
18
（3）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应
HR
—N=C=S + N—CH—COOH
PITC
H
pH8.3
H
HR
重复测定多肽 链N端氨基酸排
4
第一章 蛋白质化学
• 1.蛋白质的元素分析及应用 • 2.氨基酸的结构性质及其分离分析 • 3. 蛋白质的结构及研究方法 • 4. 蛋白质的性质 • 5. 蛋白质的提取分离和分析 • 6. 蛋白质的改性
5
第一节 蛋白质的元素分析及应用
蛋白质分子中主要的元素组成是： C：50－55％、 H：6.0－7.0％ O：20－23％ N：15－16％ S：0.3－2.5％
12
13
氨基酸分析仪工作流程图
14
15
3。氨基酸的衍生方法 （1）与茚三酮的显色反应
16
（2）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应
R
O2N
F + HN—CH—COOH
NO2
弱碱性
Sanger反应。
可用于蛋白质
R
测序
O2N
HN—CH—COOH+ HF
NO2
DNP-氨基酸，黄色
17
用萘磺酰氯取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
• 1.样品中的含氮物质是蛋白质 • 2.消化要彻底，不能有损耗 • 3.蒸馏和吸收过程密封性好 • 4.减少系统误差（蒸馏、滴定等） • 5.正确应用蛋白质系数
9
第二节、氨基酸的色谱分析
• 1．蛋白质水解法 • （1）酸水解 • 将蛋白质与约10倍体积25％硫酸或30％盐酸
在100℃左右温度下加热12～40小时，即可 将蛋白质完全水解为α-氨基酸，若加压水解 所需时间更短。 • 此水解法色氨酸被破坏，谷氨酰胺和天门冬 酰胺分别水解为谷氨酸和天门冬氨酸并释放 出NH4+。 • 工业上用毛发生产胱氨酸、面筋蛋白生产味 精及化学酱油等均是依据这一原理。
3
• 第二块：关于酶 • 1. 酶的分离和保存方法及其与蛋白质的比较 • 2. 酶的应用及其特点 • 3. 固定化酶及其应用 • 4. ELISA的原理及其应用 • 第三块：关于基因表达及其调控 • 1. 核酸结构研究新进展 • 2. DNA聚合酶 的特点及应用 • 3. PCR反应原理及其操作 • 4. 基因工程及其操作过程
—N—C—N—CH—COOH 列顺序，设计
S
PTC-氨基酸
出“多肽顺序 自动分析仪”
无水HF
S
—N—C
CN O
C
Edman反应
PTH-氨基酸
HR
19
• （4）与邻苯二甲醛反应（OPA衍生） • 在2-巯基乙醇的存在下,氨基酸与邻苯二甲
醛反应生成高荧光的衍生物,在380nm激发 时,在450nm...
• 其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于 6.25克蛋白质。
6
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 测定蛋白质含量
• 消化：
有机物＋浓H2SO4――→(NH4)2SO4＋CO2
• 蒸馏：
(NH4)2SO4＋NaOH――→Na2SO4＋NH3＋H2O
• 吸收：
NH3＋H3BO4――→ NH4＋＋H2BO4—
食品与生物工程学院研究生课程
高级生物化学
王章存 2011 .09
1
主要内容
1. 蛋白质化学 ——氨基酸分析、蛋白质结构、性质、提取分离 技术、定性定量分析、蛋白质工程、改性
2. 酶化学 ——酶催化作用的特点、酶作用机理、影响酶促 反应速度的因素、酶工程
3. 核酸 ——核酸的结构、核酸的生物合成、遗传信息的 表达、基因工程
• 2。离子交换色谱分离原理 • 广泛用于氨基酸分离分析的柱层析法。 • 离子交换树脂是水不溶性高分子化合物，一般制
成球形颗粒。它由具网状结构的高聚物作基质， 再通过化学反应引入酸性或碱性基团。 • 被引入的酸性基团如一SO3H(强酸型)或一 COOH(弱酸型)可解离出H＋离子，与溶液中其它 的阳离子交换，因而该树脂被称为阳离子酸性树 脂。 • 若树脂含有碱性基团如一N(CH3)OH(强碱型)或 NH3OH(弱碱型)时，可解离出OH－，能和溶液 里的阴离子交换，该树脂叫阴离子碱性树脂。
• 滴定：
H2BO4—＋HCl――→H3BO4 ＋Cl－
7
• 凯氏定氮法是我国国标中规定的测定蛋白质含量的方法。 • 若被测样品中的氮全是蛋白氮，则计算所得为真蛋白的含量，
否则计算值为粗蛋白含量。 • 由于不同蛋白质中的氨基酸构成不同，蛋白质的含氮量也有
差异，因而计算所用系数（即蛋白系数）略有差异。
10
• （2）碱水解法 • 一般用NaOH或Ba(OH)水解10小时以上。 • 此法水解使所有的氨基酸发生外消旋作用，
且半胱氨酸、丝、苏、精氨酸等受到破坏。 • （3）酶水法 • 条件温和。 因酶的水解专一性，无法将蛋
白质完全水解成氨基酸。多种酶的联合催化 可以完全水解蛋白质，但经济上不合算。
11
高级生化教学互动讨论主题
• 这是教学计划中安排的讨论课主题，要求同学们 围绕下列内容中的一个方面或一种方法等，也可 以结合自己本科论文，自己做ppt,并在课堂上交 流.每人5-8分钟，从第5周开始。
• 第一块：关于蛋白质 • 1. 蛋白质结构及其研究方法 • 2. 蛋白质的分离方法、原理和应用（有多种） • 3. 蛋白质测定方法及其应用特点 • 4. 免疫化学及免疫分析 • 5. 蛋白质的改性及其应用 • 6. 围绕奶粉事件谈奶粉标准的制定
蛋白种类
小麦蛋白 大麦蛋白 大米蛋白 玉米蛋白 花生蛋白 大豆蛋白
含氮％
18.58 17.15 16.81 16.00 18.32 17.51
蛋白种类 含氮％
源自文库
乳全蛋白 乳球蛋白 卵蛋白 血清白蛋白 组蛋白 明胶
15.87 16.00 15.76 15.80 17.90 18.14
8
如何正确应用凯氏定氮法 测定蛋白质含量
20
4。氨基酸分析结果
21
22
Elite-AAA氨基酸分析系统液相色谱仪
23
分析仪器实例
• Elite－AAA氨基酸分 析系统采用色谱工作 站精确控制高精度两 元液相色谱高压梯度 系统，提供精确的流 速和流动相组分控制， 采用DNFB柱前衍生 及专用氨基酸分析色 谱柱，使十八种氨基 酸能到很好的分离， 并用紫外检测器完成 氨基酸的检测。
CH3 CH3 N
pH9.
H2N—CH—COOH +
7 40℃
R
O=S=
O Cl
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
CH3 CH3 N
O=S= O HN—CH—COOH
R
DNS-氨基酸
18
（3）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应
HR
—N=C=S + N—CH—COOH
PITC
H
pH8.3
H
HR
重复测定多肽 链N端氨基酸排
4
第一章 蛋白质化学
• 1.蛋白质的元素分析及应用 • 2.氨基酸的结构性质及其分离分析 • 3. 蛋白质的结构及研究方法 • 4. 蛋白质的性质 • 5. 蛋白质的提取分离和分析 • 6. 蛋白质的改性
5
第一节 蛋白质的元素分析及应用
蛋白质分子中主要的元素组成是： C：50－55％、 H：6.0－7.0％ O：20－23％ N：15－16％ S：0.3－2.5％
12
13
氨基酸分析仪工作流程图
14
15
3。氨基酸的衍生方法 （1）与茚三酮的显色反应
16
（2）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应
R
O2N
F + HN—CH—COOH
NO2
弱碱性
Sanger反应。
可用于蛋白质
R
测序
O2N
HN—CH—COOH+ HF
NO2
DNP-氨基酸，黄色
17
用萘磺酰氯取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
• 1.样品中的含氮物质是蛋白质 • 2.消化要彻底，不能有损耗 • 3.蒸馏和吸收过程密封性好 • 4.减少系统误差（蒸馏、滴定等） • 5.正确应用蛋白质系数
9
第二节、氨基酸的色谱分析
• 1．蛋白质水解法 • （1）酸水解 • 将蛋白质与约10倍体积25％硫酸或30％盐酸
在100℃左右温度下加热12～40小时，即可 将蛋白质完全水解为α-氨基酸，若加压水解 所需时间更短。 • 此水解法色氨酸被破坏，谷氨酰胺和天门冬 酰胺分别水解为谷氨酸和天门冬氨酸并释放 出NH4+。 • 工业上用毛发生产胱氨酸、面筋蛋白生产味 精及化学酱油等均是依据这一原理。
3
• 第二块：关于酶 • 1. 酶的分离和保存方法及其与蛋白质的比较 • 2. 酶的应用及其特点 • 3. 固定化酶及其应用 • 4. ELISA的原理及其应用 • 第三块：关于基因表达及其调控 • 1. 核酸结构研究新进展 • 2. DNA聚合酶 的特点及应用 • 3. PCR反应原理及其操作 • 4. 基因工程及其操作过程
—N—C—N—CH—COOH 列顺序，设计
S
PTC-氨基酸
出“多肽顺序 自动分析仪”
无水HF
S
—N—C
CN O
C
Edman反应
PTH-氨基酸
HR
19
• （4）与邻苯二甲醛反应（OPA衍生） • 在2-巯基乙醇的存在下,氨基酸与邻苯二甲
醛反应生成高荧光的衍生物,在380nm激发 时,在450nm...
• 其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于 6.25克蛋白质。
6
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 测定蛋白质含量
• 消化：
有机物＋浓H2SO4――→(NH4)2SO4＋CO2
• 蒸馏：
(NH4)2SO4＋NaOH――→Na2SO4＋NH3＋H2O
• 吸收：
NH3＋H3BO4――→ NH4＋＋H2BO4—
食品与生物工程学院研究生课程
高级生物化学
王章存 2011 .09
1
主要内容
1. 蛋白质化学 ——氨基酸分析、蛋白质结构、性质、提取分离 技术、定性定量分析、蛋白质工程、改性
2. 酶化学 ——酶催化作用的特点、酶作用机理、影响酶促 反应速度的因素、酶工程
3. 核酸 ——核酸的结构、核酸的生物合成、遗传信息的 表达、基因工程
• 2。离子交换色谱分离原理 • 广泛用于氨基酸分离分析的柱层析法。 • 离子交换树脂是水不溶性高分子化合物，一般制
成球形颗粒。它由具网状结构的高聚物作基质， 再通过化学反应引入酸性或碱性基团。 • 被引入的酸性基团如一SO3H(强酸型)或一 COOH(弱酸型)可解离出H＋离子，与溶液中其它 的阳离子交换，因而该树脂被称为阳离子酸性树 脂。 • 若树脂含有碱性基团如一N(CH3)OH(强碱型)或 NH3OH(弱碱型)时，可解离出OH－，能和溶液 里的阴离子交换，该树脂叫阴离子碱性树脂。
• 滴定：
H2BO4—＋HCl――→H3BO4 ＋Cl－
7
• 凯氏定氮法是我国国标中规定的测定蛋白质含量的方法。 • 若被测样品中的氮全是蛋白氮，则计算所得为真蛋白的含量，
否则计算值为粗蛋白含量。 • 由于不同蛋白质中的氨基酸构成不同，蛋白质的含氮量也有
差异，因而计算所用系数（即蛋白系数）略有差异。
10
• （2）碱水解法 • 一般用NaOH或Ba(OH)水解10小时以上。 • 此法水解使所有的氨基酸发生外消旋作用，
且半胱氨酸、丝、苏、精氨酸等受到破坏。 • （3）酶水法 • 条件温和。 因酶的水解专一性，无法将蛋
白质完全水解成氨基酸。多种酶的联合催化 可以完全水解蛋白质，但经济上不合算。
11