关于基因治疗的现状与发展

一前言

基因工程是70年代初发展起来的一门技术，由于它有广阔的理论和应用前景，进展极为迅速，现已广泛应用于药品、农业、工业各方面。在医学方面，基因治疗是人们极为关注的领域，因为人类的遗传疾病有2000中以上，但却没有有效的治疗方法。遗传疾病的根本原因是基因有了缺陷基因治疗就是在机体中而基因治疗是指应用DNA 重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的[1]。也就是将有缺陷的基因换上正常的基因，并使之适当表达，基因治疗是通过基因工程手段将正常基因包括它表达所需的顺序导入该基因有缺陷的遗传病患者体内，使导入基因发挥作用，从而纠正基因缺陷所导致的各种病变。

二本论

2.1 基因治疗的概念

基因治疗可以分为两类，生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。前者关系到伦理问题后者较易进行，所以基因治疗主要从体细胞基因着手。目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。广义的基因治疗是指利用基因药物治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是体外基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗[2]。

2.2基因治疗的方法[3]

1基因转移的方法

（1）特异正常基因的分离与克隆：应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果，已有不少基因被分离和克隆，而且将有更多的基因会被克隆。在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有准确的基因定位和基因探针，任何基因都可被克隆。

在这个前提下，人工合成DNA探针和用DNA合成仪在体外人工合成基因，都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。

2外源基因转移：基因转移是将外源基因导入细胞内，其方法较多，常用的有下列几类：

物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。

a显微注射法：显微注射是在显微镜下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法一般情况下是有效的。但一次只能注射一个细胞，耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10％。但直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达后传代，这样的动物就称为转基因动物。目前成功较多的是转基因小鼠，它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。

b电穿孔法：电穿孔法是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性穿孔，使周围基质中的DNA可渗进细胞，但也有可能使细胞受到严重损伤。

c脂质体法：脂质体法是应用人工脂质体包裹外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，并使之表达。

化学法：将正常基因DNA与磷酸钙,带电荷物质和葡萄糖混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倒入培养基中与细胞接触，由于离子作用干扰细胞膜，可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在一定条件下使得到的基因得以表达，和进行细胞传代。这种方法简单易行，但效率很低，一般105个细胞中只有一个细胞可以导入结合的外源基因。要达到治疗目的，需要从病人获得大量所需的受体细胞，也可以通过选择培养的方法来提高转化率。

3同源重组法：同源重组是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该位置有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，而且筛选量大，故在临床上应用也受限制。今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。如在新基因片段旁组装特异基因，则在同源重组后，因有特异基因，可在含有新霉素的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡也是可以成功的。

4病毒介导基因法：我们前面提到的方法大多是通过转染的方法来转移基因。病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，以病毒为载体,将外源目的基因通过基因重组技术，组装于病毒上，让这种重组病毒去感染宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。

①反转录病毒载体：反转录病毒载体有如下的优点。首先是具有穿透细胞的能力，可使近100％的受体细胞感染，转化细胞效率高；其次，它感染面极广而无严格的组织特异性；而且它的病毒可长期存留，一般无害于细胞。但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体中，而不适合于不能正常分裂的细胞，如神经元细胞。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白和致癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及致癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的特性，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒。该病毒的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，最后该病毒死亡。但由于病毒整合基因组的随机性，所以还是可能激活细胞中的原癌基因，和随机插入序列导致的突变。

②DNA病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒，实用意义不大，但牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体引起突变，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出基因产物。它代表了基因治疗的新方法。最近，美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化

学连接器即赖氨酸链将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体。

采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：该病毒可感染处于不同分裂阶段的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等缺陷的纠正有特殊意义病毒颗粒相对稳定，易于纯化和浓缩，且感染力不降低可有效转导多种靶细胞后而游离于细胞基因组外，这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景[4]。

(二)靶细胞：这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则

是：耐受处理并且可循环，可再次进入人体内增殖快，生命周期长，可延续病人的整个生命周期。易于受外源遗传物质的转化在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关，故可用于免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和体内分离，又可在培养皿中生长，易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中，有将低密度脂蛋白受体基因转移至肝细胞的尝试。

2．3 基因治疗的现状

基因治疗可分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种类型。生殖细胞基因治疗，是在患者的生殖细胞中进行操作，使其后代从此再也不会得这种遗传疾病。但实际上，目前的技术水平还远远没有达到理论水平，难以解决关键的基因打靶问题，加之主动接受治疗的志愿患者甚少，还不能进入临床试验。体细胞基因治疗,是当前基因治疗研究的主流[4]。目前基因治疗的安全性是比较可靠的，其安全性远高于传统治疗法，因为基因治疗丧生的例子很少见。美国政府已经对基因治疗的安全问题发出声明，鼓励人们多尝试这种新形式的治疗方法。但是我们不排除治疗过程中的一些隐患问题。对此我们应该提高基因定位的准确性和转移载体的稳定性，在技术水平上提高安全性。此外，寻找更安全的载体和导入方法，也可以减少安全性的隐患[5]。

2．4 基因治疗的前景

在巨大的医疗需求和治愈重大疾病的潜力的驱动下，世界上第一个基因治疗产品将被商业化推出，而且迅速推动基因治疗行业形成巨大的市场，成为二十一世纪新的