细胞工程-动物细胞培养基本技术与原理

1. 动物细胞在活体内的特性
增殖 在活体内，动物细胞: 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
3.动物细胞规模化培养与现代医药
类 型
动物细胞培养的产物
治疗性抗体 小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、某些 癌症 口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血 病 尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶 原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶
促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄 体激素、促滤泡激素、生长激素 白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰 素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β -细胞生长因子
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion ) （一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录； 所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。
素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。
三、动物细胞的环境要求
1. 动物细胞培养的环境要求
1）无污染环境
2）温度
昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力 强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件
成纤维细胞型
细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则 三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。 细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维 细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。
游走细胞型 在支持物上分散生
长，不连接成片，细胞胞质常伸出 伪足或突起，呈活跃的游走和变
3）有限细胞系和永久细胞系
动物细胞离体培养起始物--原代培养（primary culture） 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有 限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在 有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
形运动，速度快而方向不规则。在
一定条件下，可转变为成纤维细胞 型。
多形性细胞型 某些组织和细胞， 如神经细胞，难以确定它们的稳 定形态，可统归于多形细胞型。
nerve cell
2）非贴壁依赖型
也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液 中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属 于此类，细胞一般呈圆形。
①培养瓶中放入1~5mm3大小的碎组织块，加5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使 终浓度为200u/ml，pH6.5； ②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次； ③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心 倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或 弃之不用）； ④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次； ⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。
2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都 需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增 殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其 周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增 加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。
化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶）
③Hanks液漂洗两次，每次2~3min； ④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。
如消化传代细胞，可与EDTA混用。
（2）胶原酶消化(collagenase
enzymatic digestion )
③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞 （不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞， 数上不数下，数左不数右。 ④计算： 细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×104× 稀释倍数 注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。
第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体
2. 培养条件下动物细胞的生长特性
离体培养的动物细胞可分为：
贴壁依赖型(anchorage-dependent)
非贴壁依赖型(anchorage-indepen型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细 胞型、多形性细胞型。
（二）组织消化(tissue
digestion)
用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。
1、常用消化液适用范围
（1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、 上皮、肝、肾、传代细胞等。 （2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。 （3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作 用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
抗体药物
人疫苗 动物疫苗
酶
激素 免疫调节因 子
4.动物克隆技术有益应用
动物克隆技术的应用前景：
（1）保存优良的动物品种
（2）拯救濒临灭绝的珍惜动物
（3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物
（4）利用克隆技术生产人体器官
二、动物细胞特性
动物细胞在活体内的特性
培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
四、动物细胞培养
基本概念和基本步骤: 取材分离和组织消化 细胞计数 常用培养法 细胞的常规检查 细胞系与克隆 动物细胞的大规模培养 细胞的冻存与复苏
一、基本概念（general concept）：
细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模
拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。 原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原 代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。 传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传 代培养的细胞称为传代细胞。
主要讲3方面问题：
动物细胞培养的主要领域及意义 动物细胞的培养特性
动物细胞培养的生存条件
一、动物细胞培养的主要领域及意义
单克隆抗体与现代医学 动物胚胎孵育与畜牧业 动物细胞培养与现代医药业 动物克隆的广泛应用
1.单克隆抗体技术与现代医学
单克隆抗体技术步骤：*
骨髓瘤细胞(myeloma cell)
2、组织消化操作方法(tissue （1）胰蛋白酶消化(trypsin 蛋白酶；
digestion method of operation) digestion)
①将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入30~50倍体积的0.25%胰 ②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。根据效果可中间更换消
活体内的动物细胞按照分裂能力可 以分为三大类：
第一类是能保持继续分裂能力的 细胞，可以继续不断地分裂，如 骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能 力的细胞，如各类高度特化的细 胞；
第三类是静止细胞群，即所谓的 G0细胞，在正常情况下，它们 不分裂，也不合成DNA，但在 受到刺激后，则重新进入细胞分 裂。如人的肝脏细胞等。
取材方法:
处死动物 → 取出组织块，放入小烧杯中 → 用尖嘴眼科剪刀
将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎
块，补加3~5ml Hanks液，用吸管轻轻吹打； →低速离心，弃去上 清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细 胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染） → 对某些软组织碎 组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。
动 物 细 胞 培 养 基 本 技 术 与 原 理
第 二 章
细胞与组织培养（体外培养）(cell and tissue culture)： 从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培 养，使之生存和生长。
包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养 分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养
贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接 种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规 模化培养的前体。
4）动物细胞的环境敏感性
动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些， 其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。
动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因
三、细胞计数(cell counting)
——计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程 度（亦用于培养液中细胞浓度的检查） ①染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4% 台盼蓝，混匀，静置2~3min； ②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色的细胞悬液，使之完 全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）
下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时
后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。